前言
長骨節段性缺損較難愈合一直是阻礙骨再生醫學發展的重要問題。重組蛋白臨床應用價格昂貴且用量多副作用大，已經不能滿足日益提高的醫療需求。美國梅奧康復醫學中心聯合MERLN創新再生醫學研究所的團隊近日在Science Advances發表了題為‘Efficient healing of large osseous segmental defects using optimized chemically modified messenger RNA encoding BMP-2’的文章。文中應用通過化學修飾的mRNA替代重組蛋白遞送到大鼠骨折部位促進骨重建再生，為骨愈合治療提供了一種創新、安全、可轉化的技術。
背景介紹
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骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，是一組具有類似結構的高度保守的功能蛋白，屬于TGF-β家族。BMP能刺激DNA的合成和細胞的復制，促進MSCs定向分化為成骨細胞。它還是體內誘導骨和軟骨形成的主要因子，并在肢體生長、骨折早期、軟骨修復時表達，對骨骼的發育和再生修復起到重要作用。
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再生醫學為修復骨缺損和產生再生骨提供了新的解決方案。重組人骨形態發生蛋白-2（rhBMP-2）等重組蛋白類新藥已被批準在美國使用，但該類新藥展現出的治療效果卻差強人意。尋找一種高效安全的局部基因遞送方法成為更具有前景的研究思路。
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mRNA是基因和其編碼蛋白之間的媒介。與DNA療法不同，不存在插入突變或其他遺傳損傷的風險。編碼特異性治療蛋白的合成mRNA容易制備，并且可以通過廉價的非病毒載體遞送到細胞內。但mRNA的不穩定性、細胞毒性和炎癥特性阻礙了其在再生醫學中的應用，對mRNA進行結構修飾和脂質載體遞送同樣也是目前研究重點。
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文章中研究者評估了一種化學修飾的mRNA（cmRNA）編碼的BMP-2修復大鼠股骨嚴重節段性缺損的能力。新生骨顯示出與天然骨相當的力學性能，且沒有重組蛋白使用后形成的大量骨痂。該研究提示了轉錄療法在加速骨愈合方面的有效性和安全性。
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研究內容
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01
為了研究化學修飾的mRNA（cmRNA）的安全性和體內藥物代謝，研究者對中段骨缺損的大鼠原位注射了攜帶螢火蟲熒光素酶Fluc的cmRNA并進行活體成像，在除治療部位外的其他身體部位未觀察到熒光。給予cmRNA治療后，體內產生大量的BMP-2蛋白，注射后第5天，蛋白質表達衰減至低水平。相比之下，應用重組人BMP-2蛋白在第1天達到高點后就開始逐漸減弱。該研究提示局部應用cmRNA的可行性及cmRNA藥物代謝的優勢。
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Figure 1. Single application of FLuc cmRNA induces robust and localized luciferase activity in the bone but is absent from the circulation and essential organs.
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02
研究者接下來對cmRNA應用的劑量依賴性進行了探究。當原位給予25ug及以上的cmRNA時產生的BMP-2蛋白能夠愈合骨缺損。給藥4周后，25ug的cmRNA劑量下骨愈合率為50%，50ug的劑量下動物骨缺損完全愈合。并且在使用cmRNA的愈合過程中，未觀察到rhBMP-2引起的大量異位骨痂形成。μCT結果顯示cmRNA組和rhBMP-2組新生骨小梁更薄，骨小梁厚度、數量和骨小梁分離度均相似。rhBMP-2組在治療4-8周過程中存在骨丟失加速的現象，而cmRNA組則表現穩定。提示了應用cmRNA治療的可取性。
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在力學方面，愈合會恢復長骨的失效扭矩值。cmRNA組在治療4周時恢復了天然骨的失效扭矩值，而此時rhBMP-2組的失效扭矩值仍然顯著低于正常。8周時，僅cmRNA組的失效扭矩顯著高于正常骨組。這表明cmRNA的作用可能使骨機械強度恢復更快。
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Figure 2. Bone healing with BMP-2 cmRNA is dose-dependent; doses >25ug are necessary to heal critically sized bone defects reliably in rats.
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03
研究者應用PCR芯片對cmRNA及rhBMP-2影響的成骨和基質形成相關基因進行了批量檢測，結果顯示二者均刺激了骨細胞外基質關鍵成分膠原、骨連接蛋白及轉化生長因子等轉錄本上調。同時參與骨重塑的酶如基質金屬蛋白酶和組織蛋白酶K也上調，提示骨缺陷修復過程中礦化組織環境的高度活躍。而只有cmRNA影響II型和X型膠原的轉錄本。II型膠原是軟骨細胞的標志，X型膠原是軟骨細胞肥大和軟骨內骨化的標志。因此治療方式的不同會導致骨愈合過程的差異，cmRNA引起軟骨內骨化，rhBMP-2引起膜內骨化。
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Figure 3. Expression of relevant osteogenic and extracellular matrix–related genes in newly formed tissue.
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04
組織學檢查證實cmRNA組和rhBMP-2組在4周和8周時骨缺損被橋接。Masson和HE染色均顯示有皮質和骨髓重建的新骨生成。與cmRNA組相比，rhBMP-2組骨痂體積更大，皮質的修復卻不明顯，提示了cmRNA應用的安全性更好。cmRNA在較低濃度時能夠增強X型膠原的表達，并刺激間充質前體的軟骨形成，但無法進一步促進軟骨內成骨。加大劑量到50ug后促進軟骨內成骨繼續到骨形成。cmRNA處理后TRAP陽性面積比顯著增加，局部IL-17A和RANKL表達增加，表明與rhBMP-2相比，cmRNA治療組織重塑效果更好。
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Figure 4. BMP-2 cmRNA administration induces de novo bone deposition in the defect.
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05
研究者又通過免疫組化發現經cmRNA治療骨缺損中存在II型和X型膠原。這些膠原的表達在低劑量cmRNA治療的骨缺損組別中最高。而II型膠原在50ug cmRNA治療后期的缺損中已不可見，推測是因為足量cmRNA加快軟骨內骨化修復。低劑量應用cmRNA治療后X型膠原的表達弱于II型膠原，無法繼續促進軟骨內骨化。經50ug cmRNA處理的缺損在4周時X型膠原已不明顯，證明足量的cmRNA治療產生的II型和X型膠原能夠加快修復進程。
Figure 5. Collagen type II deposition and chondrocytic cells are only visible within defects administered BMP-2 cmRNA,Collagen type X is clearly visible 4 weeks after BMP-2 cmRNA treatment but decreases at 8 weeks.
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06
為了評估骨缺損治療中局部炎癥因子產生情況，研究者在手術和應用cmRNA或rhBMP-2后的不同時間，測定外周血中各種炎癥因子、腫瘤壞死因子及抗炎因子的濃度。模型組和rhBMP-2治療組沒有發現細胞因子的增加。而在cmRNA治療組中，細胞因子水平顯著升高。單獨使用非編碼cmRNA會增加細胞因子的產生。當使用目的基因的cmRNA時，誘導炎癥作用進一步增強。其中對促炎細胞因子IL-1a的誘導作用特別強。而對照cmRNA組誘導炎癥的水平在第1天較低，所有組別細胞因子升高均在術后1天達到峰值，并持續至少10天。
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Figure 6. Circulating cytokines elevated as a result of cmRNA application.
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