原核表達必須要先獲取基因，通常有以下幾個途徑：

A.從物種mRNA提取反轉錄到cDNA模板，通過引物特異性擴增獲取。

B.直接從質?；蛱崛〉幕蚪M擴增獲取。

C.基因合成：不易獲取或者需要密碼子優化的基因可以考慮基因合成。

D.mRNA的獲?。簞游锝M織及細胞mRNA的提取制備

1.1 準備工作

1.1.1新鮮標本/-80凍存樣本/液氮儲存的標本（保證樣品mRNA不降解）。

1.1.2購買無RNA酶耗材/器材或器材（勻漿器，離心管及槍頭）作RNA酶清除處理：

0.1%的DEPC水浸泡過夜后用蒸餾水清洗，126滅菌30min，或用蒸餾水浸泡清洗，滅菌三次。

1.2 動物組織mRNA提取

將組織樣本轉入勻漿器中，每100mg組織樣本加入1ml Trizol提取液, 磨勻至無塊狀物【勻漿液】。

1.3 細胞RNA提取

1.3.1?提取單層貼壁生長細胞RNA：吸盡培養液后，每5～10×106個細胞加入1ml的Trizol，室溫放置5～10 min，每隔2min晃動一次裂解細胞。

1.3.2?提取懸浮生長細胞的RNA：離心沉淀細胞，每5～10×106個細胞加1ml的Trizol，反復用槍吹打或劇烈震蕩以裂解細胞。

注意事項：

a.加入Trizol前應避免洗滌細胞而增加mRNA降解的可能性。

b.細胞充分裂解無團塊。

1.4 將勻漿液轉移至離心管中，室溫放置5min。

1.5 按勻漿液/氯仿=5:1的體積比加入氯仿，劇烈震蕩15s后室溫放置5min。

1.6 12,000rpm，4離心15min，吸取水相上清至新離心管中，加入等體積預冷的異丙醇，充分混勻后置-20 1～2h或室溫0.5h。

1.7 12,000rpm，4離心10min棄上清，管底沉淀為RNA。

1.8 加入0.5～1ml 75%乙醇重懸洗滌RNA，12,000rpm離心5min。

1.9 小心吸凈液體，加入50μl ddH2O，55 5～10min即可完全溶解。

1.10 RNA保存于-80備用。

目前商品化的mRNA提取試劑/試劑盒已經非常成熟，針對不同類型的樣品應該使用不同類型的提取試劑。商品化試劑盒更能保證實驗結果的穩定，特別是適合于珍貴樣品。福因德生物推出系列RNA提取純化試劑盒可供選擇。

重組蛋白基因的獲取

2. 植物組織/細胞RNA提取

植物組織富含的酚類化合物、多糖及高活性RNase會與RNA 相互作用：酚類化合物被氧化后與RNA 不可逆地結合，導致RNA 活性喪失及在后續抽提時RNA 的丟失，或形成不溶性復合物；而多糖會形成難溶的膠狀物,與RNA 共沉淀；萜類化合物和RNase 會造成RNA 的化學降解和酶解。因此常規的RNA提取方法(如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等) 難以對所有的RNA提取都能奏效，常導致以下三種情況:提出的RNA 已被降解；RNA 的得率很低;得到的RNA 不能進行體外反轉。

針對以上問題，福因德生物通過優化配方和實驗流程，推出了適合于不同需求的植物RNA提取試劑：FrdbioR ZOL 植物總 RNA 提取試劑主要針對常規植物的RNA提?。籉rdbioR 多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒通過獨特的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解細胞和滅活RNA酶，助提劑快速結合多糖多酚物質并通過離心去除，RNA在高鹽狀態下吸附于離心柱內硅基質膜上，漂洗離心去除細胞代謝物、蛋白等雜質，低鹽溶液從硅基質膜上將RNA洗脫；最后通過DNase I消化DNA得到無DNA殘留的高質量RNA。

3.RNA的保存

mRNA非常容易降解，是該領域一個棘手問題也是個難題。針對這個問題福因德生物開發出專用的RNA保存試劑。

4.RNA質量檢測：主要包括純度檢測和完整性檢測：

4.1純度檢測：R=OD260/OD280=1.8～2.1(質控點：R< 1.8蛋白污染, R > 2.2，RNA降解，理想的R=2.0，含Tris溶液R偏高，但不超過2.2)。

4.2完整性檢測：

檢測方法瓊脂糖凝膠電泳。質量較高的RNA，電泳顯示有三條帶，并且28s是18s的兩倍，5s很弱。

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