Pre-mRNA剪接是轉錄后的一個過程，可由單個基因產生多個mRNA亞型。由于mRNA決定了蛋白質的序列和功能，剪接過程有可能擴大編碼蛋白質的種類。Pre-mRNA的表達受轉錄調控，特定mRNA的相對豐度取決于剪接環境。RNA測序表明，超過90%的人類編碼蛋白質的基因會通過pre-mRNA剪接去除內含子，內含子保留是一種常見的異常剪接類型。已有研究證明具有剪接功能的某些RNA結合蛋白（RBP)失調會促進癌癥的發生和發展。
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NONO，是一種非POU結構域的八聚體結合蛋白，屬于DBHS蛋白家族。與許多RBP相似，NONO通過多種機制發揮其多種功能，參與不同的生理和病理過程。例如，NONO參與cGAS介導的先天免疫激活，在免疫通路中直接結合病毒衣殼，修復DNA損傷以及維持端粒穩態。此外，NONO在轉錄和轉錄后不同階段的調控是至關重要的。NONO還協調代謝基因pre-mRNA的加工，尤其是內含子的去除。
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然而，NONO的功能在RNA剪接和癌癥的發生發展中還需要進一步的闡述，特別是在GBM中，這是迄今尚不明確的。癌細胞轉錄的過度激活導致需要處理的pre-mRNA增加，并且最近的研究報道了許多影響癌癥進展的異常剪接事件。因此，剪接因子是未來癌癥治療的潛在治療靶點，包括膠質母細胞瘤(GBM)的治療。然而，在GBM中內含子剪接異常的保留機制尚不明確。
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近期，山東大學李新鋼和王劍教授的腦科學團隊在Theranostics雜志上發表題為Targeting the splicing factor NONO inhibits GBM progression through GPX1 intron retention的文章，研究揭示了剪接因子NONO在GBM進展中的作用，以及靶向剪接因子來治療GBM的可能性。
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結果
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01?剪接因子NONO在GBM中高表達
研究者通過公開的TCGA數據庫，在具有mRNA剪接功能的355個蛋白中鎖定治療GBM的潛在靶點剪接因子NONO。NONO在GBM中表達顯著高于正常腦組織，且其表達量與WHO腫瘤的分級相關。免疫熒光結果顯示NONO的核定位與其剪接因子的作用相一致。綜合分析表明NONO在GBM中高表達預示著預后較差（圖1）。
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圖1 剪接因子NONO在膠質瘤中表達上調并與腫瘤分級相關
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02?剪接因子NONO影響GBM的生長
為了確定NONO在GBM發生中的潛在作用，研究人員通過siRNA和shRNA敲除細胞中的NONO。體外實驗證明NONO的丟失會導致GBM細胞系（U251）和GBM患者來源的原代細胞（P3）增殖減少，遷移與侵襲能力降低，并且細胞發生凋亡。在小鼠體內原位異種移植U251-和P3-shNONO/NC細胞，經過觀察發現，移植shNONO的細胞生長顯著降低，細胞增殖減少，且荷瘤小鼠的總生存期得以延長。綜上所述，NONO的缺失抑制腦膠質瘤增殖，促進細胞凋亡，進一步抑制了GBM侵襲和自我更新（圖2）。
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圖2 敲除NONO可抑制GBM細胞系的增殖和侵襲，促進細胞凋亡
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進一步利用慢病毒構建穩定過表達NONO的LN229和P3細胞。CCK8、EdU、克隆形成、遷移和侵襲等體外實驗表明，NONO過表達促進LN229和P3細胞的生長和侵襲。此外，在體內過表達NONO促進LN229-和P3異種移植瘤的生長，并顯著縮短小鼠的生存期（圖3）。
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圖3 NONO過表達促進GBM的增殖和侵襲
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03?剪接因子NONO通過與PSPC1相互作用介導GPX1剪接
為了探索NONO參與GBM發生的機制，研究者對U251和P3-siNONO/NC細胞進行了高通量RNA-seq分析。結果顯示，NONO會影響細胞中內含子-外顯子連接的整體剪接效率，并在TCGA數據庫GBM表達數據中進一步鎖定并分析到GPX1和CCN1的表達水平以及剪接效率下降的情況。結果表明，NONO介導了GPX1和CCN1的內含子剪接，影響二者在蛋白水平的表達。NONO的缺失導致GPX1和CCN1基因在mRNA水平顯著降低，但pre-mRNA水平保持不變或略有升高。后續結果驗證了NONO直接結合pre-mRNA中的內含子來介導GPX1和CCN1的剪接而非成熟的mRNA，并且在細胞核中觀察到GPX1的pre-mRNA與NONO的共定位現象。因此，研究者將進一步探索GPX1在NONO下游的功能（圖4）。
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圖4 GPX1和CCN1的表達受NONO介導的pre-mRNA剪接調控
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GPX1是人體最重要的抗氧化酶之一，可催化過氧化氫與谷胱甘肽反應，維持氧化還原穩態。研究人員基于RNA-seq數據進行了GO富集分析，NONO的敲除與誘導活性氧的反應有關。細胞水平NONO被敲除后，GPX活性被顯著抑制、ROS水平增加，氧化還原穩態失衡、線粒體活性降低。挽救實驗證明，通過GPX1的過表達可以部分修復GBM細胞系中由于NONO敲除所帶來的不良影響（圖5）。
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圖5 NONO的丟失通過GPX1途徑引起氧化還原失衡
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隨后NONO各結構域在介導GPX1表達過程中的作用引起了研究者的興趣，首先對NONO蛋白3個結構域（RRM1、RRM2、DBHS）分別進行突變，構建NONO-wt與3個NONO-mut的U251細胞。結果顯示只有RRM1-mut對GPX1 mRNA的表達無明顯影響，而RRM2-和DBHS-mut的細胞活力顯著降低，且RRM2結構域是NONO與pre-mRNA結合所必需的。為了進一步研究DBHS-mut細胞活力降低的原因，通過CoIP分析，最后證實了PSPC1與NONO的DBHS結構域相互作用，并且PSPC1在NONO介導的GPX1剪接過程中是必需的（圖6）。
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圖6 PSPC1協助NONO的RRM2結構域與GPX1 pre-mRNA結合并進行剪接
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04?Auranofin，是一種治療GBM的潛在分子藥物
FDA批準的治療類風濕關節炎的藥物Auranofin曾報道具有抗癌活性，也被發現可以抑制GBM中的GPX1。于是，研究者進行了體外SPR分析，發現Auranofin和NONO可以直接結合并且具有較大的親和力。細胞耐藥試驗證明Auranofin通過下調NONO和GPX1的轉錄與表達特異性影響GBM腫瘤細胞活力，且Auranofin對GPX1的抑制是由NONO所介導，促進細胞凋亡，導致線粒體功能下降，并且能夠抑制GBM細胞的侵襲。基于體外實驗的結果，在裸鼠體內建立P3原位異種移植瘤，Auranofin顯著抑制腫瘤生長，延長腫瘤承載動物的生存期。異種移植組織病理結果顯示NONO和GPX1表達降低，細胞增殖降低（圖7）。
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圖7 Auranofin通過NONO-GPX1途徑抑制GBM
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結論
該研究通過對正常細胞系、癌癥細胞系以及原代細胞中的NONO等基因進行干擾/過表達（慢病毒）。通過體內體外實驗證明了剪接因子NONO的過表達（慢病毒）促進了GBM的進展，而抑制NONO（慢病毒、shRNA）會導致GPX1中內含子的保留，進而導致ROS增加，細胞凋亡和侵襲抑制。此外，Auranofin可能通過靶向NONO介導的GPX1剪接表現出抗癌活性，Auranofin可能成為GBM患者的一種新的治療藥物，成為一種新的治療策略。??
山東大學齊魯醫院李新鋼教授、王劍教授和陳安靜研究員為本文的共同通訊作者，課題組博士研究生王旭為論文第一作者，山東大學齊魯醫院為第一作者單位和通訊作者單位。?
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