免疫組化實驗方法
?????????????????????????????? Yuanm/遠慕生物
免疫組化步驟：
1、取材：取實驗組和對照組動物組織盡可能新鮮，PBS洗，取小于0.5cm×0.5cm×0.1cm組織塊；
2、固定和包埋：用4%多聚甲醛進行固定，經70%乙醇30分鐘、80%乙醇30分鐘、90%乙醇30分鐘兩次、95%乙醇30分鐘兩次、100%乙醇30分鐘兩次、二甲苯透明15分鐘兩次、55℃石蠟中1小時三次，用不銹鋼模具包埋組織塊；?
3、切片：將厚度5um的組織切片附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜；4、脫蠟、入水：將切片浸于二甲苯中5分鐘兩次、100%乙醇5分鐘兩次、95%乙醇5分鐘兩次、90%乙醇5分鐘兩次、85%乙醇5分鐘次、70%乙醇5分鐘兩次，自來水沖洗，PBS洗兩次；
5、抗原修復:檸檬酸緩沖液，熱修復20分鐘，?PBS洗3次×5分鐘；
6、3%雙氧水,室溫10分鐘,?PBS洗3次×5分鐘；
7、切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體，不洗；
8、切片上滴加第一抗體，4℃過夜，PBS洗3次×5分鐘；
9、切片上滴加生物素化第二抗體（IgG），37℃20分鐘，PBS洗3次×5分鐘；10、切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20分鐘，PBS洗3次×5分鐘；
11、DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒1ml蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴，混勻，加至標本上，顯色6分鐘，充分水洗；
12、復染：蘇木素1分鐘，充分水洗，1%鹽酸酒精分化，1%胺水反藍，充分水洗；
13、封片：經70%乙醇5分鐘、80%乙醇5分鐘、90%乙醇5分鐘兩次、95%乙醇5分鐘兩次、100%乙醇5分鐘兩次脫水、二甲苯透明5分鐘兩次、中性樹脂封片；14、顯微鏡觀察：選擇實驗組和對照組的陽性組織相、進行400×的顯微照相。
15、圖像分析：選擇有意義的組織相，經登錄、編號、采集、分析、讀取數據、最后存盤。
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