?
?
?肝臟是脊椎動物消化系統中的一個器官，以代謝功能為主，并扮演著去毒素、氧化、肝糖原儲存、合成分泌性蛋白等重要角色。肝臟直接或間接地參與多個重要代謝途徑，與多種遺傳性疾病有關，目前已有幾百種與肝臟相關的單基因疾病的報道。因此，越來越多的科學家聚焦于借助先進技術展開對靶向肝臟的基因治療。
圖1 肝臟結構（PMID: 32483353）
得益于病毒載體的發展，借助病毒載體進行靶向肝臟的基因水平或細胞水平操作已成為科學家研究熱點。
重組腺相關病毒載體（recombinant Adeno-associated virus, rAAV）和腺病毒載體（Adenovirus）均能高效感染肝臟組織。其中腺病毒的強嗜肝性特點使其被廣泛用于肝臟的研究中，相較于其他病毒載體，腺病毒載體具有容量大、快速表達、高效轉導等優勢，但腺病毒免疫原性強，感染劇烈，故常會引起動物局部組織炎癥反應和機體免疫反應，對動物體征和實驗結果的客觀性造成影響。
rAAV載體是表達基因序列的理想載體，具有血清型種類多樣、免疫原性低、長期穩定表達基因、宿主范圍廣等優勢，在基因功能研究和基因治療遞送載體中占據主導地位。
01 rAAV載體血清型的選擇
AAV2是第一個被報道用于體內基因遞送的載體，其可以有效轉導肝細胞。隨后，一些常用血清型（AAV8、AAV9、AAV5、AAV3、AAV-DJ）及AAVhu.37、AAVrh.8等AAV血清型載體被發現可以高效轉導小鼠肝臟，其中AAV8血清型在小鼠肝臟的轉導效率更高（有報道稱通過靜脈注射對肝臟的轉導率為90%以上），且在肝臟中表達時間更長，此外，scAAV8可實現快速、高效、穩定、安全表達的目的。另有研究者發現，AAV8血清型體外轉導人肝細胞效果較差。研究者可根據實驗目的、實驗設計去選擇合適的病毒載體。
圖2 不同AAV血清型對肝臟轉導率比較（PMID: 19861950）
?
感染效果圖
圖3 和元生物測試AAV8血清型靜脈注射感染肝臟結果
?
和元生物可提供AAV1-9、AAV-DJ、AAVrh10等幾十種AAV血清型病毒包裝服務。
?
02 啟動子選擇
肝臟中細胞類型主要分為兩類：實質細胞（parenchymal cells）和非實質細胞（nonparenchymal cells），其中，實質細胞約占肝臟體積的70-80%。肝細胞（Hepatocyte）是肝臟中最主要的實質細胞，是肝臟基本功能單位—肝小葉的細胞構成，也是肝臟功能的主要承擔者，具有調節代謝、解毒的作用，參與蛋白質合成及儲存、碳水化合物轉換、膽汁的合成與分泌。因此開發高效、特異靶向肝細胞的工具尤為重要。目前，較為常用的肝細胞特異性啟動子為：TBG和Alb。此外，在肝臟組成中，還包含肝星狀細胞（Hepatic stellate cells, HSCs，也叫Ito細胞）、Kupffer細胞（ Kupffer cell, KC）和肝竇內皮細胞（liver sinusoidal endothelial cells,LSECs）等。
?
表一 常用肝細胞特異性啟動子
| 啟動子 | 細胞特異性 | |
| TBG | 甲狀腺素結合球蛋白 （Thyroxin Binding Globulin） |
肝細胞 |
| Alb | 白蛋白（Albumin） | 成年動物肝細胞（在發育中肝前體細胞中也有會表達） |
| CBh/CAG/CMV等 | 廣泛感染 | |
?
感染效果圖
圖4 和元生物測試TBG和Alb啟動子尾靜脈注射感染肝細胞結果
?
和元生物可提供CBh、CAG、CMV、EF1a等廣泛表達啟動子，亦可提供靶向肝細胞的TBG和Alb特異性啟動子，幫助您構建高效、特異性靶向肝臟的rAAV載體。
?
03 注射方式及注射劑量
進入肝臟的血管有肝動脈和門靜脈。肝動脈發自腹腔動脈干輸送富含氧氣的血液；門靜脈引消化道（腸胃、胰腺、脾臟）的靜脈血，輸送富含消化營養的血液。出肝臟的血液通過肝靜脈，匯入后腔靜脈。
基于肝臟的結構特點，靶向肝臟的rAAV載體遞送方式主要分為直接注射和系統注射。
表二 靶向肝臟的rAAV載體遞送方式
| 方法 | 優勢 | 不足 | rAAV用量 | |
| 直接注射 | 肝葉直接注射 （direct injection into the liver lobes） |
高效轉導、靶向性強 | 侵入性強、對操作有要求、手術風險大、對動物有傷害。 | — |
| 門靜脈注射 （Portal vein injection, PV） |
1E+11vg | |||
| 脾被膜注射 （splenic capsule injection） |
— | |||
| 肝動脈注射 （Hepatic artery, HA） |
— | |||
| 系統注射 | 靜脈注射 （intravenous, IV）：尾靜脈注射和眶后靜脈竇注射等 |
操作簡單 | 靶向性較直接注射差，可借助肝臟特異性啟動子實現靜脈注射特異性感染肝臟。 | 1-2E+11vg |
| 腹腔注射 （intraperitoneal, IP） |
約3E+11vg | |||
-
表中注射用量為：成年小鼠注射劑量。
圖5 靶向肝臟注射方式（PMID: 30783984）
?
注射操作視頻請點擊文末閱讀原文
?
04 應用案例
-
借助rAAV2/8載體攜帶TBG啟動子通過尾靜脈注射可特異性感染肝臟，實現對肝臟疾病的機制研究。
圖6 AAV8-TBG感染肝臟（PMID: 35100024）
?
| 病毒產品 | AAV8-TBG-SIRT3, AAV8-TBG-NRF2 |
| 實驗動物 | NRF2?/?小鼠 |
| 注射方式 | 尾靜脈注射 |
| 感染部位 | 肝臟 |
| 病毒用量 | 100 μL，2E+11VG |
?
-
借助rAAV2/8載體進行肝臟的基因水平調控，在肝骨營養不良(HOD)的發病機制中發現了一個新的肝-骨軸，涉及肝臟PP2Acα的上調，導致肝因子卵磷脂-膽固醇?；D移酶(LCAT)的表達減少，以及膽固醇從骨到肝臟的逆向轉運缺陷。（詳情請點擊【Cell Metab.】肝-骨軸缺陷促進肝性骨營養不良疾病的進展）
圖7 AAV8感染肝臟（PMID: 35235775）
?
| 病毒產品 | AAV8-Lcat，AAV8-Lcat shRNA |
| 實驗動物 | HOD鼠 |
| 注射方式 | 尾靜脈注射 |
| 感染部位 | 肝臟 |
| 病毒用量 | 2E+11VG |
?
參考文獻
[1] Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2020 Aug;17(8):457-472. DOI: 10.1038/s41575-020-0304-x
[2] Mol Ther. 2010 Jan;18(1):118-25. DOI: 10.1038/mt.2009.246
[3] Methods Mol Biol. 2019;1950:333-360. DOI: 10.1007/978-1-4939-9139-6_20
[4] Methods Mol Biol. 2011;807:141-57. DOI: 10.1007/978-1-61779-370-7_6
[5] Genes (Basel). 2020 Aug 10;11(8):915. DOI: 10.3390/genes11080915
[6] Expert Opin Biol Ther. 2021 Jun;21(6):749-766. DOI: 10.1080/14712598.2021.1865303
[7] Circulation . 2022 Feb;145(5):375-391. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.121.055600
[8] Cell Metab. 2022 Mar 1;34(3):441-457.e7. DOI: 10.1016/j.cmet.2022.02.006