什么是內毒素？ 內毒素(Endotoxin)：又稱脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)，由脂質A、菌體特異性多糖和非特異性核心多糖三部分構成，是革蘭氏陰性細菌細胞壁外壁的組成成分，單位EU/mL。內毒素對宿主是有毒性的，脂質A是內毒素的主要毒性組分。 圖1 內毒素分子結構（紫色方框所示,圖片來源參考文獻4） rAAV載體中為什么會含有內毒素？ 內毒素的釋放是由細菌死亡自溶或粘附在其他細胞時造成的，也會發生在正常細胞生長和分裂過程中。在rAAV載體制備過程中，內毒素污染主要有兩種來源：細菌內毒素和環境內毒素。由于rAAV生產所需要的質粒DNA是從大腸桿菌中分離提取的，因此質粒DNA可能含有少量內毒素；同時，rAAV制備過程中需轉染293T細胞，而細胞的生長分裂可能也會帶來內毒素的產生；此外，生產過程中的環境污染可能亦會引入內毒素。 rAAV載體中的內毒素如何檢測？ 根據藥物生產的規范要求，基于鱟試劑的內毒素測定是檢測內毒素殘留的金標準。鱟是一種海洋節肢動物，身體呈青褐色，血液呈淡藍色，鱟的血液一遇到細菌就會凝固。因此，人們利用這一特點開發出鱟試劑，即將鱟血液中的變形細胞進行溶解，將溶解物制成含有能被微量內毒素激活的凝固酶原產品，通過判斷內毒素導致的渾濁效應測試內毒素含量。 通常，鱟試劑變性細胞溶液交聯測定的敏感度是0.06個單位的內毒素EU/mL。測試樣品用重蒸水兩倍稀釋使用，測定試劑（11uL）加入到rAAV溶液，培養在37℃，60min，試管檢測膠塊的出現，檢測陽性和陰性結果。 內毒素對宿主的影響 內毒素對宿主是有毒性的，即使是少量的內毒素也可能會誘導宿主產生免疫反應。內毒素可以與細胞膜上的受體結合引起免疫反應，激活組織內的炎性細胞和炎癥因子的釋放，對細胞有較強的毒性作用，影響體內外細胞的生長和功能。在體內環境下，內毒素作用于哺乳動物，可導致機體發熱，引發全身性炎癥反應，繼而引起彌散性血管內凝血、休克、多臟器功能衰減等，最終導致死亡。因此，無論是涉及病毒載體的實驗研究還是臨床應用，我們都需要盡量去除載體的內毒素。 如何有效去除rAAV載體中內毒素 在病毒的生產中，內毒素的去除包括親和層析、緩沖液洗滌等方法，親和層析法去除內毒素具有耗時、成本高、載體回收率差等缺點。緩沖液洗滌法則是借助超濾或離子交換色譜分離LPS膠束，經過多次緩沖液交換洗滌，再用低速離心濃縮病毒培養液的方式去除rAAV載體內毒素，該方法目前在部分rAAV血清型中適用。無論哪種方法都有一定的局限性，因此，從源頭上去除內毒素至關重要。 基于12年、30000+的病毒生產經驗，和元生物持續優化病毒生產全流程，建立標準三級細胞庫，每月更換細胞，保證代次，持續降低rAAV載體的內毒素；同時，我們選擇GMP級的質粒完成病毒包裝，從源頭上控制內毒素的產生。在實際工作中，多次、隨機檢測的rAAV載體內毒素含量均＜2.5EU/ml，殘留標準超出行業普遍的<10EU/ml，為研究者提供更好的基因載體，讓基因遞送觸手可及。 別人只追求滴度時，我們還追求更有效； 別人只追求純度時，我們還追求更安全； 別人只追求承諾時，我們還追求更真實； 別人只追求周期時，我們還追求更穩定。 在看不見的地方努力， 只為給您提供穩定的高品質產品！ 和元生物用心做科研 讓基因遞送觸手可及
業務咨詢 和元生物具有豐富的rAAV包裝經驗，優化病毒生產全流程，制備的rAAV載體多次隨機檢測內毒素含量均＜2.5EU/ml，超出行業標準，滿足臨床前和臨床研究需求，如果您有相關業務需求可掃描下方二維碼聯系我們，我們將盡快與您聯系！
參考文獻
[1] Qingyun Zheng, et al., Low endotoxin E. coli strain-derived plasmids reduce rAAV vector-mediated immune responses both in vitro and in vivo. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021 Jun 24;22:293-303.doi: 10.1016/j.omtm.2021.06.009.
[2]Liudmyla Kondratova, et al., Removal of Endotoxin from rAAV Samples Using a Simple Detergent-Based Protocol. Mol Ther Methods Clin Dev. 2019 Sep 6;15:112-119.doi: 10.1016/j.omtm.2019.08.013.
[3]Jihad El Andari, et al., Production, Processing, and Characterization of Synthetic AAV Gene Therapy Vectors. Biotechnol J. 2021 Jan;16(1):e2000025.doi: 10.1002/biot.202000025.
[4] Rita F Maldonado, et al., Lipopolysaccharide modification in Gram-negative bacteria during chronic infection. FEMS Microbiol Rev. 2016 Jul;40(4):480-93.doi: 10.1093/femsre/fuw007.