?一步法sgRNA 合成試劑盒
|
||||||||||||||||||
| CRISPR/Cas9是一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術，也是細菌和古細菌為應對噬菌體和外源質粒的攻擊而演化來的一種獲得性免疫防御機制。此系統的工作原理是通過人工優化的具有引導作用的sgRNA?(Single Guide RNA)引導核酸酶Cas9蛋白在與sgRNA配對的靶位點處剪切雙鏈DNA，引起DNA斷裂，進而利用生物體內非同源末端修復機制或同源重組機制修復DNA，導致基因移碼突變、替換或刪除，致使基因功能喪失。 sgRNA的體外合成通常有兩種策略：一種為構建含特異性序列的轉錄質粒，另一種則使用合成的oligo退火延伸生成含T7轉錄啟動子的雙鏈DNA分子，進而再使用T7 RNA聚合酶進行體外轉錄，從而獲得sgRNA。利用合成的Oligo直接制備sgRNA，具有操作簡單快速、可實現高通量等優勢，已經成為體外合成sgRNA的首選方案。Cas9的切割是通過向導RNA(gRNA)與靶DNA形成約20bp堿基的配對，且靶序列的3’端需要有PAM結構(NGG)，再引導Cas9作用實現的。本試劑盒可通過一步反應獲得高純度、高產量的sgRNA，僅需要合成一條含有特定靶標序列的Oligo，可最短在4h內獲得30~50μg的sgRNA。 |
||||||||||||||||||
組份 |
||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||
原理 |
||||||||||||||||||
 |
||||||||||||||||||
儲存 |
||||||||||||||||||
| -20℃可保存2年，避免反復凍融。 | ||||||||||||||||||
實例 |
||||||||||||||||||
 |
||||||||||||||||||
| Fig. 應用一步法sgRNA合成試劑盒獲得的sgRNA，分別為37℃孵育30min、1h、2h、8h和過夜孵育的sgRNA，孵育時間越長，sgRNA產量越高。 | ||||||||||||||||||