雙光子顯微成像具備高分辨率、天然層析能力和大穿透深度等特點(diǎn)，在活體動物成像中發(fā)揮著重要作用。然而，如何在維持高分辨率的條件下，擴(kuò)大雙光子的成像視場，來滿足生物醫(yī)學(xué)中對大規(guī)模動態(tài)反應(yīng)的監(jiān)測需求，一直以來都是光學(xué)顯微成像領(lǐng)域的難點(diǎn)，也是科研關(guān)注的重點(diǎn)。
香港理工大學(xué)姚靖、余志鵬團(tuán)隊在《紅外與激光工程》發(fā)表文章，綜述了大視場雙光子成像技術(shù)的研究進(jìn)展。介紹了雙光子顯微成像系統(tǒng)的產(chǎn)生背景和設(shè)計原理，并從光學(xué)不變量的角度闡述了實(shí)現(xiàn)大視場雙光子成像的理論基礎(chǔ)，并重點(diǎn)回顧了現(xiàn)有的幾種大視場雙光子成像方法。
基于雙光子成像的高時間和空間分辨特性，大視場雙光子成像技術(shù)將成為一種在腦科學(xué)等需介觀高分辨成像領(lǐng)域的應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)大區(qū)域動態(tài)監(jiān)測的強(qiáng)有力的工具。
大視場雙光子成像的理論基礎(chǔ)
實(shí)現(xiàn)大視場、高分辨率的雙光子成像的難度在于保證分辨率的同時增加成像視場。成像物鏡的數(shù)值孔徑?jīng)Q定了系統(tǒng)成像的衍射極限分辨率，而物鏡放大倍數(shù)和視場數(shù)決定了成像系統(tǒng)的最大成像視場。
另外，在雙光子系統(tǒng)中，可用一個光學(xué)量來同時衡量各光學(xué)元件(系統(tǒng))的衍射極限分辨率和視場大小，人們稱之為光學(xué)不變量，光學(xué)不變量可同時衡量光學(xué)元件的衍射極限分辨率和視場大小。對于大視場雙光子成像系統(tǒng)，需要挑選或特殊設(shè)計具有大光學(xué)不變量的元件。
圖1.光學(xué)不變量的定義。(a)物鏡的光學(xué)不變量；(b)掃描中繼的光學(xué)不變量；(c)熒光收集系統(tǒng)的光學(xué)不變量
圖2.通過光學(xué)不變量設(shè)計大視場雙光子成像系統(tǒng)。(a)成像系統(tǒng)圖；(b) 小鼠皮層的大視場雙光子腦血管成像
具體來說，在設(shè)計大視場雙光子成像系統(tǒng)時，可將其大致分為三部分進(jìn)行分塊設(shè)計優(yōu)化，分別為成像物鏡、掃描中繼系統(tǒng)與熒光收集系統(tǒng)。在設(shè)計時，應(yīng)選擇低放大倍數(shù)的成像物鏡，并對比其光學(xué)不變量；掃描中繼系統(tǒng)應(yīng)減少大角度掃描時產(chǎn)生的離軸像差；熒光收集系統(tǒng)的光學(xué)不變量也應(yīng)等于或大于選定物鏡的光學(xué)不變量。
大視場雙光子成像與其應(yīng)用
掃描中繼系統(tǒng)的邊緣像差校準(zhǔn)
雙光子成像系統(tǒng)屬于激光點(diǎn)掃描式顯微鏡的一種，要實(shí)現(xiàn)大視場雙光子成像，必須進(jìn)行大角度掃描以增加實(shí)際光學(xué)不變量。然而，大角度掃描過程中由掃描系統(tǒng)引起的像差會對整個系統(tǒng)的成像性能造成較大影響。
2015年，Philbert S.Tsai等提出了一種使用大孔徑的多透鏡組合的方法，減小了掃描系統(tǒng)引起的像差，實(shí)現(xiàn)接近于衍射極限的高分辨率大視場雙光子成像。
圖3.透鏡組優(yōu)化大視場掃描離軸像差實(shí)現(xiàn)大視場雙光子成像系統(tǒng)。(a)成像系統(tǒng)圖；(b)視場邊緣位置和中心位置的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，由0.5µm熒光小球測得；(c)開雙顱的清醒、頭部固定的小鼠左右腦半球的大視場雙光子小動脈血管成像（波長800nm，最大強(qiáng)度投影）
該方法主要是從傳統(tǒng)光學(xué)設(shè)計角度以及光學(xué)像差的光學(xué)補(bǔ)償角度優(yōu)化大視場成像系統(tǒng)，通過補(bǔ)償大視場掃描引起的大離軸像差，最終在近衍射極限的分辨率下監(jiān)測到了不同腦區(qū)的血管以及神經(jīng)活動。
高通量物鏡的設(shè)計研發(fā)
成像物鏡的光學(xué)不變量限制了整個雙光子成像系統(tǒng)的光學(xué)不變量，也限制了最終的成像視場與分辨率。所以無論對物鏡前的光路進(jìn)行多復(fù)雜的特殊設(shè)計，最終影響整個大視場雙光子系統(tǒng)的關(guān)鍵元件仍然是物鏡。目前市面上支持大光學(xué)不變量的商業(yè)物鏡有限，同時這些商業(yè)物鏡支持的最大視場也有限。因此，要實(shí)現(xiàn)更大視場的高分辨雙光子成像，使用高通量的自制成像物鏡是將成像視場進(jìn)一步拓展的關(guān)鍵。
2016年，Nicholas James Sofroniew等設(shè)計的用于大視場成像的雙光子隨機(jī)掃描顯微鏡（2-p RAM），其最大可實(shí)現(xiàn)成像視場為5mm×5mm，并具有亞細(xì)胞級別的近衍射極限的分辨率。該系統(tǒng)使用自主設(shè)計的高性能、大光學(xué)不變量成像物鏡實(shí)現(xiàn)大視場高分辨雙光子成像。最終他們通過該系統(tǒng)對麻醉的轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)現(xiàn)了大視場的神經(jīng)活動分析。
圖4.大視場雙光子隨機(jī)掃描顯微系統(tǒng)。(a)成像系統(tǒng)圖；(b)視場邊緣位置和中心位置的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，由0.5µm熒光小球測得；(c)大視場成像麻醉thy-1小鼠熒光蛋白（最大強(qiáng)度投影）和虛線區(qū)域的細(xì)節(jié)圖
同年，Jeffrey N Stirman等設(shè)計了一款超大視場的雙光子顯微鏡，用于快速的同時掃描多區(qū)域分散的神經(jīng)細(xì)胞元群體。該大視場雙光子系統(tǒng)同樣基于自制大通量成像物鏡進(jìn)行設(shè)計。該成像物鏡具有超大的光學(xué)不變量，即具有較低放大倍數(shù)的同時具有較高的數(shù)值孔徑，從而可以實(shí)現(xiàn)大視場成像的高分辨成像。
圖5.大視場多區(qū)域雙光子掃描顯微鏡。(a)成像系統(tǒng)圖；(b)視場邊緣位置和中心位置的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，由0.5µm熒光小球測得；(c)大視場成像檢測轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)元活動，該小鼠表達(dá)GCaMP6 s鈣離子熒光指示劑。(d)分割上圖產(chǎn)生的5361個活動神經(jīng)元；(e)同時的雙區(qū)域神經(jīng)成像
該大視場成像系統(tǒng)的主要亮點(diǎn)在于同時的跨多區(qū)域成像。最終他們通過該大視場多區(qū)域系統(tǒng)測量了小鼠視覺處理過程中兩個皮層視覺區(qū)域之間的活動相關(guān)性。
總的來說，在活體生物成像中，大視場掃描的同時不可避免的會降低成像的速度，這會造成對生物組織的光漂白和光毒性增加，同時也會造成熒光信號的衰減。所以快速大視場掃描和同時多區(qū)域掃描是兩種可將大視場雙光子顯微鏡拓展至生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的有效思路。
自適應(yīng)光學(xué)方法的使用
通常情況下，商業(yè)成像物鏡都會有一個廠商標(biāo)定的最大成像視場區(qū)域。在該區(qū)域內(nèi)，物鏡廠商通過光學(xué)設(shè)計盡可能的對像差進(jìn)行優(yōu)化。而超過該標(biāo)定視場時，像差會急劇的增加。
2022年，Yao等提出一種更通用的大視場雙光子方法。該系統(tǒng)最終成像視場直徑為3.46mm，軸向分辨率為0.84μm，軸向分辨率為5.8μm。在不改變系統(tǒng)復(fù)雜度和無需復(fù)雜設(shè)計的前提下，該技術(shù)通過自適應(yīng)光學(xué)實(shí)現(xiàn)了大視場、高分辨和高信噪比的雙光子成像。
圖6.使用自適應(yīng)光學(xué)提高雙光子成像視場。(a)原理圖；(b)成像光路圖；(c)thy-1小鼠腦片的大視場成像圖（最大強(qiáng)度投影）；(d)圖(c)左下角標(biāo)示位置熒光信號通過自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)的提升
該策略通過自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)來補(bǔ)償超過標(biāo)定視場掃描過程中成像物鏡產(chǎn)生的大離軸像差。該技術(shù)具有較好的通用性，一方面不僅適用于普通的大視場雙光子成像系統(tǒng)，對于傳統(tǒng)的含高倍數(shù)物鏡的小視場雙光子顯微鏡，也可在光路前加入波前矯正元件來拓展其最大視場。另一方面，可以將該技術(shù)拓展到任何激光掃描顯微成像領(lǐng)域，通過像差補(bǔ)償元件的加入成功增加成像系統(tǒng)的可用視場。
大視場雙光子腦成像的應(yīng)用優(yōu)勢
通過各類方法提高雙光子成像系統(tǒng)的成像視場，能在保證其高分辨率的情況下，增大可探測區(qū)域。具體來說，相比于傳統(tǒng)的雙光子成像，大視場雙光子成像系統(tǒng)可將成像視場直徑拓展至5-10倍，即在保證亞細(xì)胞級別分辨率的情況下將探測區(qū)域最大拓展100倍左右。目前，雙光子用于小鼠腦成像主要有兩個方向：腦內(nèi)血管成像和腦內(nèi)神經(jīng)元或鈣離子成像。
大視場雙光子腦內(nèi)血管成像能夠分辨全腦或多腦區(qū)小鼠腦內(nèi)血管狀態(tài)，為腫瘤分析、缺血或敗血模型等病理應(yīng)用提供一種有效的工具。在小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元或鈣離子成像中，支持感覺編碼和運(yùn)動輸出的神經(jīng)元活動分布在新皮質(zhì)的多個區(qū)域。從大視場雙光子神經(jīng)元或鈣離子成像結(jié)果中可以看出，大視場雙光子成像系統(tǒng)可以同時跨多個皮層區(qū)域成像，從而獲得擴(kuò)展皮質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞分辨率視圖，這對多皮層協(xié)調(diào)的神經(jīng)活動或系統(tǒng)的闡明神經(jīng)編碼的原理至關(guān)重要。
總結(jié)與展望
大視場雙光子成像是雙光子成像領(lǐng)域的新方向，雖然已有多種大視場成像技術(shù)，但在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨設(shè)計難度和成本等問題。
未來，需要一種更通用、更具性價比的方式來解除成像視場的限制。此外，將大視場成像技術(shù)與其他領(lǐng)域技術(shù)相結(jié)合，如貝塞爾掃描技術(shù)、光透明技術(shù)和光學(xué)波前整形技術(shù)等，將是大視場雙光子成像的發(fā)展方向，有望實(shí)現(xiàn)大視場大深度的雙光子成像。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于:姚靖,余志鵬,高玉峰,葉世蔚,鄭煒,賴溥祥.大視場雙光子顯微成像系統(tǒng)研究進(jìn)展（特邀）[J].紅外與激光工程,2022,51(11):20220550.Jing Yao,Zhipeng Yu,Yufeng Gao,Shiwei Ye,Wei Zheng,Puxiang Lai.Advances of large field-of-view two-photon microscopy system (invited)[J].Infrared and Laser Engineering,2022,51(11):20220550.
