?
?
rAAV滴度
在基礎科研、臨床前研究和臨床研究中，rAAV載體的劑量一直是影響科研數據和基因治療效果的重要因素，rAAV基因組拷貝精確病毒滴定（即病毒滴度）也是rAAV載體質控的重要組成之一。rAAV滴度通常是通過測量衣殼蛋白或rAAV基因組來確定的。
過去幾年出現的幾起rAAV基因療法致死事件，均與接受高劑量rAAV有關，因此在實際研究或臨床治療中并非rAAV的劑量越高，效果就越好。研究報道，過高劑量的rAAV，隨著衣殼劑量的增加，使得對衣殼特異性T細胞活化，誘導免疫反應從而清除轉導的靶細胞，導致治療效果喪失，甚至由于嚴重的免疫反應導致死亡。低劑量的rAAV有可能被anti-AAV抗體，甚至低滴度的中和抗體中和，從而導致效果不明顯。因此精確的rAAV滴度測定、合適的載體劑量范圍區間，是保證使用最佳效果的重要前提。
?
圖1 載體劑量與系統載體轉染后效果之間的關系
（Mingozzi et al., 2013）
?
rAAV空殼率
rAAV載體的純度要求和雜質控制是載體制備、純化、質控過程中的重要因素，是順利開展臨床前實驗和臨床研究的先決條件。在rAAV載體制備過程中，除了含有全長DNA基因組的完整rAAV載體外，有一定比例的rAAV顆粒不含任何DNA基因組，被稱為空病毒顆粒。
?
大量空病毒顆粒的存在可能會影響rAAV載體的有效性和安全性，它們可能作為抗原的供應源，引起細胞免疫毒性；亦有可能競爭細胞表面受體結合位點，影響轉錄效率。因此優化生產工藝，探索控制空殼rAAV產生的辦法；建立有效純化方式，去除空殼rAAV是rAAV載體生產工藝重要任務，對于獲得可靠、穩定、有效的研究數據至關重要。
?
圖2 和元生物rAAV載體生產空殼率
電鏡結果：包裝DNA基因組的病毒顆粒為實心顆粒（紅色箭頭）；空病毒顆粒中間存在空洞（黃色箭頭）
?
rAAV內毒素
除空病毒顆粒等rAAV相關性雜質外， rAAV生產過程中殘留的內毒素也可能是導致宿主免疫反應的原因之一。內毒素的釋放主要是由細菌死亡自溶或粘附在其他細胞時造成的，也會發生在正常細胞生長和分裂過程中。因此，在rAAV載體制備過程中，無論是所需的質粒DNA、轉染的293T細胞，亦或是生產環境均有可能引入內毒素。
?
rAAV載體的內毒素可能會誘導宿主產生免疫反應，對細胞有較強的毒性作用，也會導致機體發熱，引發全身性炎癥反應，最終導致死亡。因此，無論是實驗研究還是臨床應用，都需要盡量去除載體的內毒素。rAAV載體中內毒素的去除有一定的局限性，成本高且載體回收率差，因此從源頭上控制內毒素的產生尤為重要。
如何獲得高質量的rAAV載體
隨著rAAV載體的基礎研究和臨床應用的不斷發展，使用高質量的rAAV載體可以為實驗數據的穩定性和可靠性及臨床治療的安全性和有效性提供保障。
?
基于12年、30000+的病毒生產經驗，和元生物持續優化病毒生產全流程，選擇GMP級的質粒，官方授權的293T細胞完成病毒包裝。建立標準三級細胞庫，每月更換細胞，保證代次；優化質粒配比、病毒收獲時間，借助超離、PEG沉淀、超濾、層析等科研及工業生產中的整合純化工藝，持續降低rAAV載體的空病毒顆粒及內毒素殘留，經多次隨機檢測rAAV載體空殼率<2%、內毒素含量均＜2.5EU/mL，遠超出行業標準。同時，對生產的每批rAAV產品在出庫前均會進行物理滴度測定，通過qPCR絕對定量的方式進行基因組拷貝數測定和考馬斯亮藍染色檢測病毒衣殼蛋白，以保證產品的滴度準確。
?
?
?
別人只追求滴度時，我們還追求更有效；
別人只追求純度時，我們還追求更安全；
別人只追求承諾時，我們還追求更真實；
別人只追求周期時，我們還追求更穩定。
?
在看不見的地方努力，
只為給您提供穩定的高品質產品！
?
?
和元生物用心做科研
讓基因遞送觸手可及
?
?
?
業務咨詢
想要獲取高質量的rAAV載體？那就趕緊掃描下方二維碼聯系我們吧，我們將盡快回復您！
?
參考文獻
?
[1] Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 2013 Jul 4;122(1):23-36. doi: 10.1182/blood-2013-01-306647. Epub 2013 Apr 17. PMID: 23596044; PMCID: PMC3701904.