生物素（Biotin）標記效率檢測

生物素標記摩爾比的計算是基于比爾-朗伯定律（Beer–Lambert law），又稱比爾定律或比耳定（Beer's law），是分光光度法的基本定律，即當一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質時，其吸光度（Absorbance，A）與吸光物質的濃度（Consenreation，C）及吸收層厚度（length，L）成正比, 用公式表示為：A = ε*C* L其中A為光度，ε為摩爾吸光系數,所以此處公式為A 500= ε500 C L（此ε500=34,000M-1cm-1）（4-羥基苯偶氮）苯甲酸(2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid ,英文縮寫HABA)可以與親和素特異性結合，其結合復合物為一種黃色或者橘黃色，在500nm有最大吸光值；但是其結合力遠遠低于生物素與親和素的結合，當溶液中存在生物素的時候，生物素會強競爭讓HABA解離下來,引起吸光值下降?；诖嗽恚梢愿鶕?00nm吸光值的變化計算出蛋白標記生物素的量（被標記蛋白與生物素的摩爾比）

實驗操作可以選擇分光光度法或微孔酶標板法：

分光光度法：

A． 取900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯，在500nm波長測量吸光值，記錄為A_500(H-A);最好測量三次取平均值；

B． 在比色杯中加入100uL待測的生物素標記蛋白（Biotinylated Protein,簡稱BP），充分混勻后，在500nm波長測量吸光值，吸光值穩定20秒以上，記錄為A_500(H-A-BP);最好測量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)<0.35,請用PBS稀釋待測樣品，再次重復此步驟。

微孔酶標板法：

A.      取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波長測量吸光值，記錄為A_500(H-A);最好測量三次取平均值；

B.      在微孔板中加入20uL待測的生物素標記蛋白（Biotinylated Protein,簡稱BP），震蕩或移液器吹打充分混勻后，在500nm波長測量吸光值，吸光值穩定20秒以上，記錄為A_500(H-A-BP);最好測量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)< 0.3*A_500(H-A),請用PBS稀釋待測樣品，再次重復此步驟。

標記效率計算方法：

1）蛋白摩爾濃度計算：mM /mL

2）生物素摩爾濃度計算(分光光度計法)：mM /mL

其中吸光值變化(分光光度比色皿)：ΔA₅₀₀=（0.9* A_500(H-A)）- A_500(H-A-BP)

3）生物素摩爾濃度計算（微孔板法）：mM /mL

其中吸光值變化(微孔酶標板)：ΔA₅₀₀=A_500(H-A)- A_500(H-A-BP)

備注：使用標準96孔微孔板，200ul液體，其液面高度（光程）為0.58cm

4）標記摩爾比計算：

生物素：蛋白=[(生物素摩爾濃度*10)/蛋白原始摩爾濃度]*稀釋倍數

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