有限蛋白水解質譜技術（Limited Proteolysis Mass Spectrometry，LiP-MS）是研究小分子化合物（天然產物、代謝物等）與蛋白質相互作用，揭示蛋白結構動態變化的高通量質譜篩選技術。本公司推出LiP-MS藥物靶點篩選解決方案，包含三種研究目的場景：

• LiP-MS藥物靶點篩選：體外生理條件下尋找小分子藥物的潛在作用靶點；
• LiP-MS藥物-蛋白結合域分析：體外生理條件下研究純化重組蛋白與目標藥物的作用域與結合位點。
• LiP-MS藥物機制研究：體內給藥條件下研究小分子藥物的潛在作用靶點及其藥物作用機制。

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技術原理

有限水解（LiP）的概念是指在生理狀態下蛋白酶對蛋白的不完全酶切。研究表明，生理狀態下折疊的蛋白具有較強的抗酶切能力，所以實驗中想要實現對蛋白的完全酶切需要先對蛋白進行變性處理（去折疊）（圖1）。而在生理狀態下，折疊蛋白的不完全酶切也需要蛋白酶識別位點的暴露，通常涉及到多達12以上氨基酸殘基肽段的構象變化(局部展開)，這依賴于蛋白的動態變化，蛋白表面肽段的柔性變化可能會形成這種能被蛋白酶識別切割的位點。

圖 1 蛋白有限水解示意圖

LiP-MS利用有限水解的原理來識別小分子藥物作用的蛋白靶點。具體來講，生理狀態下蛋白的動態變化會暴露出表面肽段的酶切位點，但是小分子藥物與靶蛋白結合后，會在整體或者局部水平穩定蛋白的結構，這使得蛋白表面的肽段暴露和被蛋白酶酶切的可能性大大降低（圖2）。

在這個理論背景下，設置藥物處理組與溶劑處理的對照組，同時以非特異性的蛋白酶進行處理，會在藥物結合的靶蛋白上形成酶切位點（肽段）的差異，最后通過質譜檢測來定量篩選出組間差異的肽段（蛋白），最終可以確認為藥物作用的結合靶點（圖3）。

圖 2 小分子配體（藥物）穩定蛋白結構

圖 3 LiP-MS流程圖

產品優勢

• 簡單便捷：無需設計合成分子探針；提供野生型細胞/組織和藥物分子就可以進行實驗；
• 真實直接：使用藥物分子在體外直接進行結合實驗，得到直接結合靶點及其結合位點；
• 數據驅動：利用質譜技術的高通量性能，無偏見的數據驅動篩選保障獲得真實的陽性結果，實現治療靶點與脫靶靶點的全覆蓋；
• 直接結論：通過比較篩選、生信分析和數據庫挖掘，報告直接給出推薦的靶點列表清單；
• 驗證數據：對潛在靶蛋白與藥物分子進行分子對接，在計算機模擬層面給藥物靶點進行驗證；

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產品介紹

LiP-MS藥物靶點篩選

藥物靶點研究最常見的場景是有了一個有效的藥物，但是不清楚這個藥物作用的具體靶點和機制。這個時候可以進行蛋白質組水平的LiP-MS藥物靶點篩選。客戶提供原始的細胞或組織及藥物，譜度眾合實驗室在非變性條件下提取疾病模型細胞/組織中的全部蛋白，分別使用藥物和溶劑進行處理，隨后進行有限水解實驗，通過質譜高通量篩選兩組間差異肽段，實現在整體蛋白水平篩選藥物作用的蛋白靶點。

送樣要求：

1. 至少6個給藥前樣本（藥物處理組3個，溶劑對照組3個；如需增加不同濃度或者不同藥物處理組，每組增加3個樣本）；

2. 單個樣本起始細胞量建議>1*10E7（組織樣本＞5mg）;藥物用量：摩爾分子質量/10（μg），例如分子量1000的藥物，需要100μg的量；或者20μL*5mM的藥物溶液。

3. 收集細胞/組織樣本時需以PBS清洗干凈，樣本不含有任何去垢劑/變性劑成分。

LiP-MS藥物-蛋白結合域分析

該產品應用于一個特殊的藥物靶點研究場景：已經明確了藥物作用的靶蛋白，但是不清楚藥物作用在蛋白上的哪個位置（區域），可以通過對重組蛋白的LiP-MS實驗來實現研究目的。客戶提供純化重組蛋白及藥物，譜度眾合實驗室進行體外的重組蛋白和藥物分子結合實驗，隨后進行有限水解實驗，通過高分辨質譜來分析藥物作用所產生的差異肽段，結合分子對接可以獲得明確的藥物-蛋白結合區域信息。

送樣要求：

1. 至少6個給藥前樣本（藥物處理組3個，溶劑對照組3個；如需增加不同濃度或者不同藥物處理組，每組增加3個樣本）；

2. 單個樣本起始重組蛋白量建議>5μg（總量大于30μg，濃度不低于0.05μg/μL）；

3. 重組蛋白溶液中不含有任何去垢劑/變性劑成分。

LiP-MS藥物機制研究

該產品用于體內/活細胞給藥條件下篩選藥物靶點，同時提供藥物進入機體/細胞后引起的生理/病理變化（蛋白表達變化），以提供藥物作用分子機制?？蛻籼峁┙浰幬?溶劑對照處理后的細胞/組織樣本，譜度眾合實驗室分成胰蛋白酶直接處理的定量比較組和有限水解處理后的結構比較組。通過定量比較組可以得到藥物處理下蛋白表達變化結果。結構比較組數據經過定量比較組校正之后得到藥物作用后蛋白結構變化信息（肽段差異），進而篩選藥物作用靶點蛋白。

實驗設計：

圖4 LiP-MS藥物機制研究實驗方案

送樣要求：

1. 至少12個給藥/溶劑處理后的樣本（藥物處理組3個，溶劑對照組3個；藥物處理有限水解組3個，溶劑對照組有限水解組3個）；

2. 單個樣本起始細胞量建議>1*10E7（組織樣本＞5mg）;

3. 收集細胞/組織樣本時需以PBS清洗干凈，樣本不含有任何去垢劑/變性劑成分。

報告結果

我們將LiP-MS的實驗結果分成四個板塊進行展示。其中第一部分是質譜檢測結果的質控；第二部分差異分析及候選靶點篩選結果是主要的靶蛋白篩選結果，也是文章里使用的主要結果；第三部分生信功能分析與潛在靶點挖掘提供對第二部分篩選出的候選靶點的生信功能富集分析，可以輔助我們挑選最終的靶蛋白。第四部分靶蛋白結構分析與分子對接提供靶蛋白與藥物分子的結合信息，可以作為輔助驗證的結果。

[1]. 蛋白質組學檢測及質控結果

圖 5 蛋白質組學檢測質控數據

質譜質控結果，包括肽段長度分布、肽段電荷分布、蛋白肽段數目分布，肽段酶切類型分布

符合理論預期的質控結果能證明項目在實驗處理和質譜檢測階段的穩定性。例如，項目使用蛋白酶K處理，肽段酶切類型中半特異性酶切肽段占比較高。

圖 6 項目蛋白肽段鑒定數據

實驗樣品通過布魯克高性能Tims-tof pro質譜儀進行4D-DIA檢測分析。項目在六個樣品中共定量到了34053條unique肽段，歸屬于4455個unique蛋白。其中各組重復實驗樣品的蛋白肽段鑒定數據如圖。

[2]. 差異分析及候選靶點篩選結果

圖 7 肽段定量差異分析火山圖與熱圖

對比較組的肽段定量數據進行差異倍數計算和T檢驗，篩選出藥物處理組樣品中的差異變化肽段。項差異肽段所對應的蛋白即為藥物潛在靶蛋白。是項目中篩選藥物靶點的核心部分結果。

[3]. 生信功能分析與潛在靶點挖掘

圖 8 生信功能分析與潛在靶點挖掘

注釋富集分析，項目中包括GO、KEGG富集分析，蛋白互作網絡（PPI）分析。潛在靶點挖掘（從AnimalTFDB4/PhosphoSitePlus/TCDB/TTD/CellChatDB等數據庫中對實驗所鑒定到的差異蛋白中的轉錄因子、激酶、離子通道蛋白、藥物靶點和受體蛋白等潛在藥物靶點蛋白進行注釋）。這些分析內容可以為進一步的靶點篩選與驗證提供理論支持。

[4]. 靶蛋白結構分析與分子對接

圖 9 蛋白結構標注與分子對接

LiP-MS技術通過對蛋白肽段的差異分析來篩選藥物作用靶點，差異肽段在蛋白結構上的位置可以在一定程度上提供藥物結合位置信息。在蛋白二級序列對本次實驗所鑒定到的差異蛋白及肽段進行標注，分子對接通過計算機模擬計算藥物和蛋白的結合力及結合位點，結合實驗篩選到的蛋白差異肽段位置信息，能為藥物和蛋白的相互作用提供有力的證據。

服務配置表