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有限蛋白水解質(zhì)譜技術(shù)（Limited Proteolysis Mass Spectrometry，LiP-MS）是研究小分子化合物（天然產(chǎn)物、代謝物等）與蛋白質(zhì)相互作用，揭示蛋白結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的高通量質(zhì)譜篩選技術(shù)。本公司推出LiP-MS藥物靶點(diǎn)篩選解決方案，包含三種研究目的場(chǎng)景：

• LiP-MS藥物靶點(diǎn)篩選：體外生理?xiàng)l件下尋找小分子藥物的潛在作用靶點(diǎn)；
• LiP-MS藥物-蛋白結(jié)合域分析：體外生理?xiàng)l件下研究純化重組蛋白與目標(biāo)藥物的作用域與結(jié)合位點(diǎn)。
• LiP-MS藥物機(jī)制研究：體內(nèi)給藥條件下研究小分子藥物的潛在作用靶點(diǎn)及其藥物作用機(jī)制。

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技術(shù)原理

有限水解（LiP）的概念是指在生理狀態(tài)下蛋白酶對(duì)蛋白的不完全酶切。研究表明，生理狀態(tài)下折疊的蛋白具有較強(qiáng)的抗酶切能力，所以實(shí)驗(yàn)中想要實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的完全酶切需要先對(duì)蛋白進(jìn)行變性處理（去折疊）（圖1）。而在生理狀態(tài)下，折疊蛋白的不完全酶切也需要蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的暴露，通常涉及到多達(dá)12以上氨基酸殘基肽段的構(gòu)象變化(局部展開)，這依賴于蛋白的動(dòng)態(tài)變化，蛋白表面肽段的柔性變化可能會(huì)形成這種能被蛋白酶識(shí)別切割的位點(diǎn)。

圖 1 蛋白有限水解示意圖

LiP-MS利用有限水解的原理來識(shí)別小分子藥物作用的蛋白靶點(diǎn)。具體來講，生理狀態(tài)下蛋白的動(dòng)態(tài)變化會(huì)暴露出表面肽段的酶切位點(diǎn)，但是小分子藥物與靶蛋白結(jié)合后，會(huì)在整體或者局部水平穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)，這使得蛋白表面的肽段暴露和被蛋白酶酶切的可能性大大降低（圖2）。

在這個(gè)理論背景下，設(shè)置藥物處理組與溶劑處理的對(duì)照組，同時(shí)以非特異性的蛋白酶進(jìn)行處理，會(huì)在藥物結(jié)合的靶蛋白上形成酶切位點(diǎn)（肽段）的差異，最后通過質(zhì)譜檢測(cè)來定量篩選出組間差異的肽段（蛋白），最終可以確認(rèn)為藥物作用的結(jié)合靶點(diǎn)（圖3）。

圖 2 小分子配體（藥物）穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)

圖 3 LiP-MS流程圖

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

• 簡(jiǎn)單便捷：無需設(shè)計(jì)合成分子探針；提供野生型細(xì)胞/組織和藥物分子就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；
• 真實(shí)直接：使用藥物分子在體外直接進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，得到直接結(jié)合靶點(diǎn)及其結(jié)合位點(diǎn)；
• 數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)：利用質(zhì)譜技術(shù)的高通量性能，無偏見的數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)篩選保障獲得真實(shí)的陽性結(jié)果，實(shí)現(xiàn)治療靶點(diǎn)與脫靶靶點(diǎn)的全覆蓋；
• 直接結(jié)論：通過比較篩選、生信分析和數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘，報(bào)告直接給出推薦的靶點(diǎn)列表清單；
• 驗(yàn)證數(shù)據(jù)：對(duì)潛在靶蛋白與藥物分子進(jìn)行分子對(duì)接，在計(jì)算機(jī)模擬層面給藥物靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證；

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產(chǎn)品介紹

LiP-MS藥物靶點(diǎn)篩選

藥物靶點(diǎn)研究最常見的場(chǎng)景是有了一個(gè)有效的藥物，但是不清楚這個(gè)藥物作用的具體靶點(diǎn)和機(jī)制。這個(gè)時(shí)候可以進(jìn)行蛋白質(zhì)組水平的LiP-MS藥物靶點(diǎn)篩選。客戶提供原始的細(xì)胞或組織及藥物，譜度眾合實(shí)驗(yàn)室在非變性條件下提取疾病模型細(xì)胞/組織中的全部蛋白，分別使用藥物和溶劑進(jìn)行處理，隨后進(jìn)行有限水解實(shí)驗(yàn)，通過質(zhì)譜高通量篩選兩組間差異肽段，實(shí)現(xiàn)在整體蛋白水平篩選藥物作用的蛋白靶點(diǎn)。

送樣要求：

1. 至少6個(gè)給藥前樣本（藥物處理組3個(gè)，溶劑對(duì)照組3個(gè)；如需增加不同濃度或者不同藥物處理組，每組增加3個(gè)樣本）；

2. 單個(gè)樣本起始細(xì)胞量建議>1*10E7（組織樣本＞5mg）;藥物用量：摩爾分子質(zhì)量/10（μg），例如分子量1000的藥物，需要100μg的量；或者20μL*5mM的藥物溶液。

3. 收集細(xì)胞/組織樣本時(shí)需以PBS清洗干凈，樣本不含有任何去垢劑/變性劑成分。

LiP-MS藥物-蛋白結(jié)合域分析

該產(chǎn)品應(yīng)用于一個(gè)特殊的藥物靶點(diǎn)研究場(chǎng)景：已經(jīng)明確了藥物作用的靶蛋白，但是不清楚藥物作用在蛋白上的哪個(gè)位置（區(qū)域），可以通過對(duì)重組蛋白的LiP-MS實(shí)驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)研究目的。客戶提供純化重組蛋白及藥物，譜度眾合實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體外的重組蛋白和藥物分子結(jié)合實(shí)驗(yàn)，隨后進(jìn)行有限水解實(shí)驗(yàn)，通過高分辨質(zhì)譜來分析藥物作用所產(chǎn)生的差異肽段，結(jié)合分子對(duì)接可以獲得明確的藥物-蛋白結(jié)合區(qū)域信息。

送樣要求：

1. 至少6個(gè)給藥前樣本（藥物處理組3個(gè)，溶劑對(duì)照組3個(gè)；如需增加不同濃度或者不同藥物處理組，每組增加3個(gè)樣本）；

2. 單個(gè)樣本起始重組蛋白量建議>5μg（總量大于30μg，濃度不低于0.05μg/μL）；

3. 重組蛋白溶液中不含有任何去垢劑/變性劑成分。

LiP-MS藥物機(jī)制研究

該產(chǎn)品用于體內(nèi)/活細(xì)胞給藥條件下篩選藥物靶點(diǎn)，同時(shí)提供藥物進(jìn)入機(jī)體/細(xì)胞后引起的生理/病理變化（蛋白表達(dá)變化），以提供藥物作用分子機(jī)制。客戶提供經(jīng)藥物/溶劑對(duì)照處理后的細(xì)胞/組織樣本，譜度眾合實(shí)驗(yàn)室分成胰蛋白酶直接處理的定量比較組和有限水解處理后的結(jié)構(gòu)比較組。通過定量比較組可以得到藥物處理下蛋白表達(dá)變化結(jié)果。結(jié)構(gòu)比較組數(shù)據(jù)經(jīng)過定量比較組校正之后得到藥物作用后蛋白結(jié)構(gòu)變化信息（肽段差異），進(jìn)而篩選藥物作用靶點(diǎn)蛋白。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

圖4 LiP-MS藥物機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)方案

送樣要求：

1. 至少12個(gè)給藥/溶劑處理后的樣本（藥物處理組3個(gè)，溶劑對(duì)照組3個(gè)；藥物處理有限水解組3個(gè)，溶劑對(duì)照組有限水解組3個(gè)）；

2. 單個(gè)樣本起始細(xì)胞量建議>1*10E7（組織樣本＞5mg）;

3. 收集細(xì)胞/組織樣本時(shí)需以PBS清洗干凈，樣本不含有任何去垢劑/變性劑成分。

報(bào)告結(jié)果

我們將LiP-MS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分成四個(gè)板塊進(jìn)行展示。其中第一部分是質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)控；第二部分差異分析及候選靶點(diǎn)篩選結(jié)果是主要的靶蛋白篩選結(jié)果，也是文章里使用的主要結(jié)果；第三部分生信功能分析與潛在靶點(diǎn)挖掘提供對(duì)第二部分篩選出的候選靶點(diǎn)的生信功能富集分析，可以輔助我們挑選最終的靶蛋白。第四部分靶蛋白結(jié)構(gòu)分析與分子對(duì)接提供靶蛋白與藥物分子的結(jié)合信息，可以作為輔助驗(yàn)證的結(jié)果。

[1]. 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)及質(zhì)控結(jié)果

圖 5 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)

質(zhì)譜質(zhì)控結(jié)果，包括肽段長(zhǎng)度分布、肽段電荷分布、蛋白肽段數(shù)目分布，肽段酶切類型分布

符合理論預(yù)期的質(zhì)控結(jié)果能證明項(xiàng)目在實(shí)驗(yàn)處理和質(zhì)譜檢測(cè)階段的穩(wěn)定性。例如，項(xiàng)目使用蛋白酶K處理，肽段酶切類型中半特異性酶切肽段占比較高。

圖 6 項(xiàng)目蛋白肽段鑒定數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)樣品通過布魯克高性能Tims-tof pro質(zhì)譜儀進(jìn)行4D-DIA檢測(cè)分析。項(xiàng)目在六個(gè)樣品中共定量到了34053條unique肽段，歸屬于4455個(gè)unique蛋白。其中各組重復(fù)實(shí)驗(yàn)樣品的蛋白肽段鑒定數(shù)據(jù)如圖。

[2]. 差異分析及候選靶點(diǎn)篩選結(jié)果

圖 7 肽段定量差異分析火山圖與熱圖

對(duì)比較組的肽段定量數(shù)據(jù)進(jìn)行差異倍數(shù)計(jì)算和T檢驗(yàn)，篩選出藥物處理組樣品中的差異變化肽段。項(xiàng)差異肽段所對(duì)應(yīng)的蛋白即為藥物潛在靶蛋白。是項(xiàng)目中篩選藥物靶點(diǎn)的核心部分結(jié)果。

[3]. 生信功能分析與潛在靶點(diǎn)挖掘

圖 8 生信功能分析與潛在靶點(diǎn)挖掘

注釋富集分析，項(xiàng)目中包括GO、KEGG富集分析，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析。潛在靶點(diǎn)挖掘（從AnimalTFDB4/PhosphoSitePlus/TCDB/TTD/CellChatDB等數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)實(shí)驗(yàn)所鑒定到的差異蛋白中的轉(zhuǎn)錄因子、激酶、離子通道蛋白、藥物靶點(diǎn)和受體蛋白等潛在藥物靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行注釋）。這些分析內(nèi)容可以為進(jìn)一步的靶點(diǎn)篩選與驗(yàn)證提供理論支持。

[4]. 靶蛋白結(jié)構(gòu)分析與分子對(duì)接

圖 9 蛋白結(jié)構(gòu)標(biāo)注與分子對(duì)接

LiP-MS技術(shù)通過對(duì)蛋白肽段的差異分析來篩選藥物作用靶點(diǎn)，差異肽段在蛋白結(jié)構(gòu)上的位置可以在一定程度上提供藥物結(jié)合位置信息。在蛋白二級(jí)序列對(duì)本次實(shí)驗(yàn)所鑒定到的差異蛋白及肽段進(jìn)行標(biāo)注，分子對(duì)接通過計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算藥物和蛋白的結(jié)合力及結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)篩選到的蛋白差異肽段位置信息，能為藥物和蛋白的相互作用提供有力的證據(jù)。

服務(wù)配置表