單抗是個好東西，但是一提到單抗，很多人就腦殼疼，理論容易實踐難。

l  融合一次兩次不長

l  亞克隆檢測滿板黑或者滿板白

l  好不容易得到個陽性，污染了

l  歷經千辛萬苦沒篩到自己想要的抗體

做技術的都是性情中人，從不吝嗇于分享自己的“私房秘技”

首先，小鼠免疫這關需要過

盡信書則不如無書，書上說可以用6-8周的Balb/c小鼠將進行免疫，其實這個十分不妥，一般來說用于免疫的小鼠一定要根正苗紅，種系來源要好，很多實驗室為了省錢，買只公鼠再買只母鼠回來自己繁殖飼養，這樣的老鼠質量是不過關的，有時候打腹水都不長，那你可能會說那我干脆用它來做飼養細胞吧，我要告訴你多此一舉，我會告訴你不用飼養細胞的辦法；對于老鼠的周齡，最好選用8周齡以上的，這樣免疫效果會更好，我們發現6周齡的小鼠免疫后經過應激以及免疫刺激后，往往個頭僵化，生長停滯，效價也不高，這是我們肉眼可以觀察到的事情，肉眼沒有看到的很多負面影響還暗藏其中，嚴重影響我們的實驗效果。性格火急的實驗者拿到小鼠就用，心急吃不了熱豆腐；拿到合格的Balb/c小鼠之后，我如果告訴你，對于大多數的抗原在2-4周可以完成免疫你相信么？我們采用的是類似于狂犬疫苗的免疫程序，使用的是Frdbio水溶性納米佐劑，比傳統的弗氏佐劑效果要好，使用起來更為簡便。傳統的弗氏佐劑乳化起來非常麻煩，特別是對于體積較小的微量抗原，乳化更為麻煩，相對損失量更高。傳統的弗氏佐劑主要成分是礦物油和多糖，有的是用羊毛脂，礦物油的有機成分很可能會影響到抗原的二級結構，所以我們想要篩選到構象表位的抗體，對于比較珍貴的抗原，建議盡可能考慮水溶性納米佐劑。我們的大量案例表明，使用水溶性佐劑21天左右ELISA測試的效價可以大于1:10^6。

融合前的免疫沖擊，如果可以通過尾靜脈沖擊做好，如果做不到老老實實打腹腔。

其次，細胞培養和融合

細胞培養的基本技能自不必說，做到不污染，操作標準，動作嫻熟，習慣要好，細胞消化（SP2/0不需要消化）和傳代要做到火候正好，如果該換液的時候不換液，細胞由于缺少營養老死，半死不活，后期及時挽救回來也已經變性了。很多人傳細胞細胞用蠻力使勁吹打培養基起泡，勢必影響細胞，會對細胞造成機械性損傷；捶打時間過長，培養基變成紫紅色的，液回造成細胞裂解；市面上T25和T75的培養瓶由于設計的原因，往往脖頸那部分細胞不容易吹到，再次分瓶培養的時候，這部分細胞會老死，影響整體的細胞群質量。

真正優良的SP2/0在顯微鏡下觀察應該是一粒一粒的，像鋼豆，大小均勻，沒有或者很少有異形細胞，且密度適中均勻，沒有漂浮細胞。做單抗SP2/0來源一定要正，市面上那么多的SP2/0，大家傳來傳去，性能各異，很多已經不太適合于做融合了，或者效率很低，后者后期即使融合成功，細胞株很難穩定，篩選不到陽性克隆。很多實驗者聽信民間偏方把SP2/0注射到老鼠的背部，讓其恢復活力，其實這個有點扯淡了，所謂恢復的活力是生長活力，不是融合和作為Fusion Partner的活力，我不知道我是否說清楚這個問題了。一般正規的單抗公司，會定期對sp2/0進行亞克隆，獲取眾多單克隆集落，分別測試其作為Fusion Partner應該具有的專業屬性，然后放大培養，凍存一批保種，每次取用一支，用到一兩個月直接丟棄，再重新取新的一支復蘇使用。對于一般科研院所或者小公司，不可能有精力做這件事情，再加上對于SP2/0使用頻率一般不是很高，從正規來源獲取細胞，小心凍存一批原種足夠應付實驗普通的單抗工作。

再次，融合血清很重要

很多人做單抗細胞融合，反反復復就是不成功，都快憋出內傷。細胞融合所涉及的幾個關鍵試劑培養基，融合劑、培養血清和HAT試劑。其中血清作為緊要，如果融合操作規范，長不出集落十有八九是血清問題，正規的單抗公司都會定期向血清廠家索要不同批號的血清小樣進行細胞融合測試，擇優購買測試效果最好的批次，于小公司或者科研院所實驗室一般是是做不到這個工作的。購買單抗融合專用血清是比較好的選擇，但是市面上號稱單抗細胞融合血清的也是很多，需要擦亮眼睛，仔細甄選。其實還有更好的選擇，直接購買可以適合于細胞融合的培養基直接使用，成本并不比自己用血清配制的高，最關鍵的是這個培養基再融合細胞鋪板的時候不需要你加入飼養細胞，是不是很驚喜，是不是很意外；這個培養基還可以直接用于亞克隆，同樣不需要制備飼養細胞。殺老鼠制備飼養細胞還是有點小痛苦的，一不小心還會污染。

最后，就是篩選問題

單抗篩選的最常用的手段是間接ELISA方法，這是初篩最好的利器。我們在實際工作中經常會遇到滿板子都是藍色或者滿板子都是白板，這個就需要我們在篩選之前建立好ELISA實驗方法，至于方法怎么建，參照抗體效價的檢測（ELISA）。經過初篩后，我們會得到陽性孔，陽性孔經過補液二次復篩之后就可以進行亞克隆了，初篩和亞克越早越好，一般融合后7-10天內，因為越晚的話，陽性孔里面如果有非目標細胞，它們生長速度要比目標細胞快很多，會嚴重覆蓋目標細胞，造成后期亞克不到目標陽性細胞。為什么需要二次補液復篩呢?因為陽性孔里面的抗體可能是前期細胞（包括沒有融合的細胞和融合期不穩定細胞）生長留下來的，二次補液之后，如果孔內分泌抗體的陽性細胞不在了，二次篩選值會很低或者陰性。

做單抗，大家最不喜歡得到的是IgM亞型，原因是這個玩意后期很難純化，怎么才能避免篩選到IgM亞型抗體細胞株呢?我們在間接ELIS時選用剔除針對IgM亞型的羊抗小鼠IgGs-HRP即可，世面上很少有這種抗體，我們也是在實踐中快被憋出內傷的時候才研發出這款二抗[Goat anti-mouse(IgGs-IgM)(AffiniPure ,Horseradish Peroxidase conjugated]

至于篩選還是要提及的一個問題，間接ELISA只是初選，你最終希望抗體達到什么樣的境界，你最好在細胞上清階段就設計出這樣的技術方案；基于現實的種種原因，可能在上清階段實施終極應用抗體驗證很困難，比如受到培養液成分干擾，收到上清培養液量少或者抗體總量偏少等等的干擾?？傊瑔慰故呛苷\實的，你用什么樣的條件篩選那你就得到什么樣的抗體。

對于污染問題，那是實驗室控制問題，實驗習慣問題，加上所使用實際的問題了，最招人恨的是支原體污染；其他的細菌污染一般用雙抗生素就解決了，實在不行用個三抗，真菌問題，一般不太會出現，除非實驗室大面積污染。支原體污染太普遍了，在污染不是很嚴重的情況下，細胞株又非常珍貴的話，可以試試我們的除支原體試劑。

關于亞克隆

亞克隆是個體力和技術活，教科書上我們在亞克隆的時候平均沒孔0.8個細胞，這樣沒孔分到1個細胞的概率最高，這個是根據一個概率分布原理，在理想狀態下的一個分配概率，事實上，由于細胞的狀態和自身特性，已經培養基支持細胞生長能力問題，亞克隆的時候平均每孔分配的細胞數量是需要做適當修正的，也就是說我們如果過每孔按照0.8個細胞去亞克隆的話，估計很多孔里是長不出克隆的，經過實驗室實驗驗證，我們在使用本公司生產的單抗亞克隆專用培養基的情況下，如果按每孔平均分配2個細胞的情況下，長出單克隆細胞的孔數的可能性最大，具體分配多少個細胞最為合適？這需要根據各自實驗室情況各自修正，另外，細胞計數一定要準確，至少技術兩次，如果兩次計數的結果差異不大，數字才可以采信。我們使用這款培養基進行亞克隆最大的優勢是不需要加飼養細胞，隨時隨地可以進行亞克隆，既避免殺小鼠，又可以減少工作量，還可以避免不必要的人為造成的污染。

傳統單克隆抗體技術經久不衰，經典的就是經典的，新的單抗新技術又不斷催生，比如基因工程抗體，目前這個技術比較熱門，特別是兔單克隆抗體技術更是吵得火熱。感興趣的小伙伴繼續關注我們，我們后期會推出更多實用秘籍，讓你輕松入門基因工程抗體（兔單克隆抗體）。

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