考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度的原理、步驟及注意事項
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- 蛋白質濃度測定的方法有很多，考馬斯亮藍測定蛋白質是實驗室最常見的一種方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作簡便，下文遠慕生物介紹了考馬斯亮藍測定蛋白質濃度的原理、優缺點、操作以及注意事項。
實驗原理
考 馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質―染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優 點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。
考 馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm變為 595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。通過測定595 nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發現，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。
考馬斯亮藍染色法的突出優點是：
(1)靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1 mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質-染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。
(2)測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。
(3)干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
此法的缺點是：
(1)由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍染色法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用g—球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。
(2)仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。
試劑與器材
一、試劑
考馬斯亮藍試劑：
考馬斯亮藍G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000 mL。
二、標準和待測蛋白質溶液
1. ?標準蛋白質溶液
結晶牛血清蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL蛋白溶液。
2. ?待測蛋白質溶液。
人血清，使用前用0.15 mol/L NaCl稀釋200倍。
三、器材
試管1.5×15 cm(×6)，試管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒溫?水浴;?分光光度計?。
操作方法
一、制作標準曲線
取7支試管，按下表平行操作。
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試管編號 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
標準蛋白溶液（mL） |
0 |
0.01 |
0.02 |
0.03 |
0.04 |
0.05 |
0.06 |
|
0.15mol/LNaCl（mL） |
0.1 |
0.09 |
0.08 |
0.07 |
0.06 |
0.05 |
0.04 |
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考馬斯亮藍試劑 |
? ? ?5 mL |
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搖勻，1h內以0號管為空白對照，在595 nm處比色 |
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? |
? | ? | ? | ? | ? | ? | ? |
繪制標準曲線：以A595?nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。
二、未知樣品蛋白質濃度測定
測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標準曲線的直線范圍內。根據所測定的A595?nm值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。
注意事項
在試劑加入后的5-20 min內測定光吸收，因為在這段時間內顏色是最穩定的。
測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。
利用考馬斯亮藍法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用，重復測定吸光度時，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標準曲線的時候，蛋白標準品最好是從低濃度到高濃度測定，防止誤差。