? ? ? ? 質譜流式技術實現在單細胞水平檢測幾十個通道的同時檢測，可以系統全面的分析病理狀態下各類免疫細胞在表型和功能上的變化，從中發現一些新的免疫細胞亞群、揭示新的免疫機制。近年來，越來越多的實驗室將質譜流式用于HIV的相關的研究，至2020年年初，已經有二十余篇文章發表，主要涉及HIV病毒感染不同階段免疫系統的變化以及ART治療相關免疫機制等方面。
01
HIV病毒感染過程中對于不同免疫亞群的影響
? ? ? ? CD4+ T 細胞是HIV 病毒的主要攻擊對象，也是該領域內最受關注的細胞種類。2017 年，在Cell Rep.報道的一項研究中，美國 Gladstone 病毒與免疫研究所利用體外實驗研究了HIV 感染對于CD4+T 細胞的影響。利用質譜流式，研究人員細致分析了不同感染時間點CD4+T 細胞38 個表面marker 的表達，對T 細胞表型進行了精細的亞群和降維分析。短期融合實驗（2h）表明，HIV 對CD4+T 的結合是具有選擇性的，它只結合包含記憶CD4+ T 細胞（CD4+ Tm）在內的部分細胞；而長期感染實驗(4day)則揭示了宿主細胞與病毒之間復雜的相互作用關系：一方面CD4+T 的表型在此過程中發生了顯著的變化(如圖1)；另一方面，在不同T 細胞亞群中，病毒基因的表達情況也有顯著不同。例如CD57+和CD127+Tm 都會感染HIV，但是病毒基因只在前者里面表達，提示在部分CD4+T 細胞中對于HIV 病毒存在“post-entry block”機制[4]。
注意B 圖中，由于幾個主要marker 的表達發生較大改變，在tsne 圖中，相當一部分被感染細胞（藍色）已經無法和未感染（紅色）細胞重合。圖片來源：[4]
? ? ? ? 2018 年 Manganaro 等人在此方向進行了更深入的研究，利用質譜流式HIV 感染的T 細胞進行了19 個通道的同時檢測，研究人員發現IL-15 可以促進CD4+ Tm 干細胞的增殖，顯著改變CD4+ Tm 的組成，在建立具有自我更新能力的HIV 存儲庫的過程中發揮關鍵作用，相關信號通路的抑制劑則保護CD4+Tm 免受病毒的感染。[3]
? ? ? ? 除了CD4+Tm 以外，TFH(濾泡輔助T，follicular helper T)也是該領域一個研究熱點。Tfh 表達 CXCR5，這使得它們能夠歸巢到淋巴結的T 細胞和B 細胞區域之間的界面，它們通過抗原呈遞與B 細胞相互作用，在促進B 細胞分化和親和力成熟中起著不可或缺的作用。因此HIV 對于TFH 活性的影響直接影響患者體液免疫功能的發揮。2018 年Sci Immunol.發表的Wendel BS 等人關于HIV 慢性感染者TFH 的研究。利用質譜流式對病人淋巴結T 細胞進行了37 個marker 的同時檢測，通過進行tSNE 和DenVM 分析，作者發現，與健康對照相比，HIV 患者具有更多的CD38+TFH 細胞，具有單一表達IL-21 的激活型表型。(如圖2)后續實驗結果表明在慢性感染階段TFH 細胞依然可以對HIV 抗原做出反應，但在持續抗原刺激作用下功能發生傾斜，僅具有非常有限的TCR 克隆譜系[2] ；
左圖：全部細胞的亞群組成，中圖右圖顯示健康對照和HIV患者，圖片來源文獻[2]
? ? ? ? 此外，質譜流式還可以幫助研究者發現一些疾病相關的新亞群，揭示發病過程一些新的免疫機制。2019年Del Alcalza D等人利用質譜流式檢測了HIV感染的淋巴結T細胞上36個marker的表達，系統分析了CD4+T細胞的亞群組成。研究發現，患者淋巴結內存在一群可以分泌IL-21的CXCR5-細胞。后續的細胞功能試驗和TCR受體測序結果說明其具有和TFH類似的功能，并具有部分重合的TCR克隆譜系，同時該群細胞對外周血CXCR5-CD4+T cells也有貢獻。這些信息串在一起，揭示了一個在HIV慢性感染過程中連接淋巴結病理學和循環T細胞的新機制，拓展了我們對于T調節B細胞功能多樣性的認識。[5]。
2）CD8+ T
? ? ? ? 耗竭型CD8+T細胞是HIV進入慢性感染的標志。2018年Bengsch等人利用質譜流式對患者耗竭型CD8+T(Tex)的表型進行了深入研究。基于前期表觀遺傳的數據，作者篩選了16多個與功能耗竭相關marker加入質譜流式Panel進行分析，從單細胞的水平分析Tex的耗竭表型。經過PhenoGraph聚類，他們得到了在9個表型不同的Tex細胞亞群，定義了不同抑制性受體在各個Tex亞群上的表達組合模式。然后，根據他們的比例信息，制作了表征疾病狀態的指標。這對于研究慢性感染，自身免疫和癌癥中的免疫監測和免疫調節機制都具有重要意義(如圖3)。[1]
（圖片來源文獻[1]）
3）其他免疫細胞
? ? ? ? 此外，還有多想研究通過質譜流式分別對于HIV感染者DC、NK、PMN，Macrophage等其他免疫亞群的深入的表型和功能分析。他們的研究從不同側面展示了HIV感染對于人體免疫系統帶來的巨大影響，揭示了HIV感染過程中，慢性免疫激活的建立和維持，以及最后導致免疫衰竭的諸多重要分子機制。[9][10][11][15][7]
? ? ? ? 在ART治療過程中，伴隨病毒水平的降低，免疫細胞各種marker的表達及功能活性也發生了復雜的變化，這些現象對于研究ART治療的作用機制，探索更有有效的治療手段至關重要。質譜流式以其多通道的優勢，有力了支持了這些方向研究。
? ? ? ? 2019年 Bekele Y為首的研究小組利用質譜流式分析了在不同感染期接受ART治療的病人外周血樣本，通過對比研究人員發現，急性感染期開始ART治療的病人比慢性期開始ART治療的病人具有更豐富的CD27, CD28, CD127, CD44高表達T細胞亞群，這提示前者保留了更好的免疫功能。[6]
小結：
? ? ? ? 綜上，通過單細胞水平的多參數檢測，質譜流式可以全面系統的分析分析HIV病毒感染不同階段以及治療過程中免疫系統的表型和功能改變，為人類進一步了解和控制該疾病提供了有益的探索。在腫瘤等其他疾病的研究中，科研人員已經通過質譜流式找到了一些用于臨床診斷和預后的生物標志物[22,23]，相信未來在HIV的研究領域，還將有更多的更加貼近臨床的研究和發現。
參考文獻
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1. Epigenomic-Guided Mass Cytometry Profiling Reveals Disease-Specific Features of Exhausted CD8 T Cells
Bengsch B, Ohtani T, Khan O, Setty M, Manne S, O'Brien S, Gherardini PF, Herati RS, Huang AC, Chang KM, Newell EW, Bovenschen N, Pe'er D, Albelda SM, Wherry EJ.
Immunity. 2018 May 15;48(5):1029-1045.e5. doi: 10.1016/j.immuni.2018.04.026.
2. The receptor repertoire and functional profile of follicular T cells in HIV-infected lymph nodes
Wendel BS, Del Alcazar D, He C, Del Río-Estrada PM, Aiamkitsumrit B, Ablanedo-Terrazas Y, Hernandez SM, Ma KY, Betts MR, Pulido L, Huang J, Gimotty PA, Reyes-Terán G, Jiang N, Su LF.
Sci Immunol. 2018 Apr 6;3(22):eaan8884. doi: 10.1126/sciimmunol.aan8884.
3. IL-15 regulates susceptibility of CD4(+) T cells to HIV infection
Manganaro L, Hong P, Hernandez MM, Argyle D, Mulder LCF, Potla U, Diaz-Griffero F, Lee B, Fernandez-Sesma A, Simon V.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Oct 9;115(41):E9659-E9667. doi: 10.1073/pnas.1806695115. Epub 2018 Sep 26.
4. Mass Cytometric Analysis of HIV Entry, Replication, and Remodeling in Tissue CD4+ T Cells
Cavrois M, Banerjee T, Mukherjee G, Raman N, Hussien R, Rodriguez BA, Vasquez J, Spitzer MH, Lazarus NH, Jones JJ, Ochsenbauer C, McCune JM, Butcher EC, Arvin AM, Sen N, Greene WC, Roan NR.
Cell Rep. 2017 Jul 25;20(4):984-998. doi: 10.1016/j.celrep.2017.06.087.
5. Mapping the Lineage Relationship between CXCR5(+) and CXCR5(-) CD4(+) T Cells in HIV-Infected Human Lymph Nodes
Del Alcazar D, Wang Y, He C, Wendel BS, Del Río-Estrada PM, Lin J, Ablanedo-Terrazas Y, Malone MJ, Hernandez SM, Frank I, Naji A, Reyes-Terán G, Jiang N, Su LF.
Cell Rep. 2019 Sep 17;28(12):3047-3060.e7. doi: 10.1016/j.celrep.2019.08.037.
6. Mass cytometry identifies distinct CD4+ T cell clusters distinguishing HIV-1-infected patients according to antiretroviral therapy initiation
Bekele Y, Lakshmikanth T, Chen Y, Mikes J, Nasi A, Petkov S, Hejdeman B, Brodin P, Chiodi F.
JCI Insight. 2019 Feb 7;4(3):e125442. doi: 10.1172/jci.insight.125442. [Epub ahead of print]
7. Upregulation of Chitinase 1 in Alveolar Macrophages of HIV-Infected Smokers
Logue EC, Neff CP, Mack DG, Martin AK, Fiorillo S, Lavelle J, Vandivier RW, Campbell TB, Palmer BE, Fontenot AP.
J Immunol. 2019 Mar 1;202(5):1363-1372. doi: 10.4049/jimmunol.1801105. Epub 2019 Jan 21.
8. Mass Cytometry Analysis Reveals the Landscape and Dynamics of CD32a(+) CD4(+) T Cells From Early HIV Infection to Effective cART
Coindre S, Tchitchek N, Alaoui L, Vaslin B, Bourgeois C, Goujard C, Avettand-Fenoel V, Lecuroux C, Bruhns P, Le Grand R, Beignon AS, Lambotte O, Favier B; ANRS CO6 PRIMO Cohort.
Front Immunol. 2018 Jun 4;9:1217. doi: 10.3389/fimmu.2018.01217. eCollection 2018.
9. Mass Cytometry Analysis Reveals Complex Cell-State Modifications of Blood Myeloid Cells During HIV Infection
Coindre S, Tchitchek N, Alaoui L, Vaslin B, Bourgeois C, Goujard C, Lecuroux C, Bruhns P, Le Grand R, Beignon AS, Lambotte O, Favier B.
Front Immunol. 2019 Nov 22;10:2677. doi: 10.3389/fimmu.2019.02677. eCollection 2019.
10. CD161 Defines a Functionally Distinct Subset of Pro-Inflammatory Natural Killer Cells
Kurioka A, Cosgrove C, Simoni Y, van Wilgenburg B, Geremia A, Bj
Front Immunol. 2018 Apr 9;9:486. doi: 10.3389/fimmu.2018.00486. eCollection 2018.
11. Characterization of Leukocytes From HIV-ART Patients Using Combined Cytometric Profiles of 72 Cell Markers
Leite Pereira A, Tchitchek N, Lambotte O, Le Grand R, Cosma A.
Front Immunol. 2019 Aug 6;10:1777. doi: 10.3389/fimmu.2019.01777. eCollection 2019.
12. TIGIT is upregulated by HIV-1 infection and marks a highly functional adaptive and mature subset of natural killer cells
Vendrame E, Seiler C, Ranganath T, Zhao NQ, Vergara R, Alary M, Labbé AC, Guédou F, Poudrier J, Holmes S, Roger M, Blish CA.
AIDS. 2020 Feb 5. doi: 10.1097/QAD.0000000000002488. doi: 10.1097/QAD.0000000000002488. [Epub ahead of print]
13. Identification of NK Cell Subpopulations That Differentiate HIV-Infected Subject Cohorts with Diverse Levels of Virus Control
Pohlmeyer CW, Gonzalez VD, Irrinki A, Ramirez RN, Li L, Mulato A, Murry JP, Arvey A, Hoh R, Deeks SG, Kukolj G, Cihlar T, Pflanz S, Nolan GP, Min-Oo G.
J Virol. 2019 Mar 21;93(7):e01790-18. doi: 10.1128/JVI.01790-18. Print 2019 Apr 1.
14. New assays for monitoring residual HIV burden in effectively treated individuals
Strain MC, Richman DD.
Curr Opin HIV AIDS. 2013 Mar;8(2):106-10. doi: 10.1097/COH.0b013e32835d811b.
15. Mass Cytometry Reveals the Immaturity of Circulating Neutrophils during SIV Infection
Lemaitre J, Cosma A, Desjardins D, Lambotte O, Le Grand R.
J Innate Immun. 2019 Jun 21:1-12. doi: 10.1159/000499841. [Epub ahead of print]
16. Standardization and quality control for high-dimensional mass cytometry studies of human samples
Kleinsteuber K, Corleis B, Rashidi N, Nchinda N, Lisanti A, Cho JL, Medoff BD, Kwon D, Walker BD.
Cytometry A. 2016 Oct;89(10):903-913. doi: 10.1002/cyto.a.22935. Epub 2016 Aug 30.
17. A high-resolution mass cytometry analysis reveals a delay of cytokines production after TLR4 or TLR7/8 engagements in HIV-1 infected humans
Leite Pereira A, Tchitchek N, Marcos Lopez E, Lambotte O, Le Grand R, Cosma A.
Cytokine. 2018 Nov;111:97-105. doi: 10.1016/j.cyto.2018.08.018. Epub 2018 Aug 20.
18. Comprehensive mass cytometry analysis of cell cycle, activation, and coinhibitory receptors expression in CD4 T cells from healthy and HIV-infected individuals. Corneau, A. et al.? Cytometry B Clinical Cytometry 92 (2017): 21–32.
19. Comprehensive Mass Cytometry Analysis of Cell Cycle, Activation, and Coinhibitory Receptors Expression in CD4 T Cells from Healthy and HIV-Infected Individuals
Corneau A, Cosma A, Even S, Katlama C, Le Grand R, Frachet V, Blanc C, Autran B.
Cytometry B Clin Cytom. 2017 Jan;92(1):21-32. doi: 10.1002/cyto.b.21502.
20. VOLARE: visual analysis of disease-associated microbiome-immune system interplay
Siebert JC, Neff CP, Schneider JM, Regner EH, Ohri N, Kuhn KA, Palmer BE, Lozupone CA, G C.BMC Bioinformatics. 2019 Aug 20;20(1):432. doi: 10.1186/s12859-019-3021-0.
21. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies
Trapecar M, Khan S, Roan NR, Chen TH, Telwatte S, Deswal M, Pao M, Somsouk M, Deeks SG, Hunt PW, Yukl S, Sanjabi S.
AIDS Res Hum Retroviruses. 2017 Nov;33(S1):S31-S39. doi: 10.1089/AID.2017.0208.
22. An immune atlas of clear cell renal cell carcinoma. Chevrier, S. et al.
Cell 169 (2017): 736–749.
23 High-dimensional single-cell analysis predicts response to anti-PD-1 immunotherapy.
Krieg, C. et al. Nature Medicine 24 (2018): 144–153.
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