[Frdbio標記技術(shù)]-抗體標記成功的關(guān)鍵
對抗體進行修飾標記的，是我們免疫檢測中必行之徑；
經(jīng)常有實驗者詢問：為啥抗體標記不成功或者標記效率低，
在排除你所使用的試劑或者試劑盒的問題之外，我們首先必須處理好自己的樣品-抗體
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1） 抗體的濃度和純度必須準確，對于蛋白抗體濃度的測試，市面上有商業(yè)的試劑盒，比如BCA，Bradford 方法，用不同方法測試的濃度值，往往相差甚遠，可能更多的受到溶液成分的干擾； Frdbio獨自鐘愛SDS-PAGE法，這個方法的操作就是通過標準濃度BSA濃度與樣品在同塊PAGE上平行電泳，通過染色脫色平行做濃度比對得出結(jié)果，我們認為這個結(jié)果更可靠一點，這個是真正“看得見摸得著的”。
2） 抗體溶液的離子環(huán)境問題，我們首要關(guān)注的是游離的銨離子問題，我們抗體溶液中的游離銨離子濃度經(jīng)常超標，而這些超標的銨離子濃度是標記的致命影響因素，因為90%以上的標記試劑盒標記的抗體活性基團是-NH2. 在我們純化的過程中，我們一般會用到甘氨酸洗脫， 1.0M Tris-Cl中和，這里面含有大量的游離氨，會喧賓奪主，優(yōu)先與其反應(yīng)。
如果我們用到0.1-0.15M 甘氨酸洗脫，然后等體積1.0M Tris-Cl中和的話，我們樣品里面游離氨基含量為0.55M，通常1mg/ml抗體的濃度為6.67uM,通常我們透析不一定能夠完全把這個Tris和甘氨酸去掉，取決于透析液體積，透析離子交換時間，透析次數(shù)；而往往標準的SOP僅僅告訴“透析3次，每次2小時”，其實這個不嚴謹?shù)牟襟E；那么我們?nèi)绻贸瑸V法去除游離胺離子，0.5ml的離心管，12000rpm 5分鐘，每次可以置換掉400ul,按照這個置換量計算，理想狀態(tài)下至少要置換6次才能將Tris和甘氨酸濃度將為抗體濃度的1%
能標記抗體的試劑盒一般也可以標記蛋白，蛋白制備的方法紛繁復雜，其中可能引入更多含有游離氨基的物質(zhì)，比如尿素等。所有不管我們標記什么我們都必須處理好自己樣品問題。