1. 培養(yǎng)基的配制
第一次亞克隆，一般用HT完全培養(yǎng)基（含1×HT和20%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基），配制方法：20%胎牛血清+1%雙抗(鏈霉素和青霉素，100×)+1/50體積的HT（50×）+1640不完全培養(yǎng)基。
2. 飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備
參照以上“4.飼養(yǎng)細(xì)胞/融合細(xì)胞準(zhǔn)備”相關(guān)內(nèi)容，最后將細(xì)胞重懸在HT完全培養(yǎng)基，備用。對(duì)于初學(xué)者建議選用雜交瘤培養(yǎng)添加劑（Frdbio,MCC0014）。
3. 細(xì)胞亞克隆
細(xì)胞亞克隆的目的是為了得到單個(gè)細(xì)胞（單克隆）分裂生長(zhǎng)的細(xì)胞，這樣所產(chǎn)生的抗體的性質(zhì)都是一樣的。一般采用有限稀釋法，當(dāng)然也可以考慮半固體培養(yǎng)基法。半固體培養(yǎng)基法可參照以上《雜交瘤細(xì)胞鋪板培養(yǎng)中》的《半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)》相關(guān)內(nèi)容，本節(jié)內(nèi)容主要介紹有限稀釋法。
教科書(shū)和參考資料一般是建議將細(xì)胞稀釋到平均每孔0.8個(gè)細(xì)胞，此時(shí)含有單個(gè)細(xì)胞的孔的概率最高；但是，這個(gè)方法并不科學(xué)，原因是不同實(shí)驗(yàn)體系對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的支持并不一樣，并不是每孔單細(xì)胞都可以順利存活成長(zhǎng)起來(lái)，所以，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室需要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)體系測(cè)試最佳的單孔平均細(xì)胞個(gè)數(shù)。
陽(yáng)性細(xì)胞稀釋到平均每孔某個(gè)確定的個(gè)數(shù)，分種到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板里，置于5% CO2 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天左右觀察，選取只含有單集落細(xì)胞孔進(jìn)行上清檢測(cè)；如果單集落孔達(dá)到50%以上，且所選擇的單集落孔檢測(cè)的結(jié)果為100%陽(yáng)性即可認(rèn)為此細(xì)胞為單克隆細(xì)胞株，以雜交瘤細(xì)胞原始孔編號(hào)為其命名。將亞克隆后的細(xì)胞株放大，可進(jìn)行腹水生產(chǎn)。如果檢測(cè)結(jié)果達(dá)不到100%陽(yáng)性則需要從本次亞克隆所獲得細(xì)胞株中陽(yáng)性值最高的孔繼續(xù)進(jìn)行第二次亞克隆。
亞克隆得到的細(xì)胞株需要進(jìn)行多種實(shí)驗(yàn)條件的驗(yàn)證，ELISA驗(yàn)證只能算是篩選；常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證條件有免疫印跡（Western Blot），免疫熒光(IF)、免疫組化(IHC）等等，如果要進(jìn)行下游產(chǎn)品開(kāi)發(fā)還需要進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。