1. 培養基的配制
第一次亞克隆，一般用HT完全培養基（含1×HT和20%胎牛血清的1640完全培養基），配制方法：20%胎牛血清+1%雙抗(鏈霉素和青霉素，100×)+1/50體積的HT（50×）+1640不完全培養基。
2. 飼養細胞的準備
參照以上“4.飼養細胞/融合細胞準備”相關內容，最后將細胞重懸在HT完全培養基，備用。對于初學者建議選用雜交瘤培養添加劑（Frdbio,MCC0014）。
3. 細胞亞克隆
細胞亞克隆的目的是為了得到單個細胞（單克?。┓至焉L的細胞，這樣所產生的抗體的性質都是一樣的。一般采用有限稀釋法，當然也可以考慮半固體培養基法。半固體培養基法可參照以上《雜交瘤細胞鋪板培養中》的《半固體培養基培養》相關內容，本節內容主要介紹有限稀釋法。
教科書和參考資料一般是建議將細胞稀釋到平均每孔0.8個細胞，此時含有單個細胞的孔的概率最高；但是，這個方法并不科學，原因是不同實驗體系對細胞生長的支持并不一樣，并不是每孔單細胞都可以順利存活成長起來，所以，每個實驗室需要根據自己的實驗體系測試最佳的單孔平均細胞個數。
陽性細胞稀釋到平均每孔某個確定的個數，分種到含有飼養細胞的96孔板里，置于5% CO2 37℃細胞培養箱中培養，5天左右觀察，選取只含有單集落細胞孔進行上清檢測；如果單集落孔達到50%以上，且所選擇的單集落孔檢測的結果為100%陽性即可認為此細胞為單克隆細胞株，以雜交瘤細胞原始孔編號為其命名。將亞克隆后的細胞株放大，可進行腹水生產。如果檢測結果達不到100%陽性則需要從本次亞克隆所獲得細胞株中陽性值最高的孔繼續進行第二次亞克隆。
亞克隆得到的細胞株需要進行多種實驗條件的驗證，ELISA驗證只能算是篩選；常見的實驗驗證條件有免疫印跡（Western Blot），免疫熒光(IF)、免疫組化(IHC）等等，如果要進行下游產品開發還需要進行進一步實驗。