直接測量細胞運動
·將細胞運動與細胞增殖區分開
·沿著遷移前端分割并跟蹤單個細胞
·表征傷口愈合過程中的形態、行為細胞表型
引言:
傷口愈合測定是一種體外測定集體細胞遷移的實驗。該測定的基礎是在融合的細胞層內通過劃痕來移除黏附的細胞或者通過在接種過程中通過物理障礙來清除細胞，從而形成無細胞區域。一旦創建了無細胞區域，就可以通過活細胞成像來監測傷口愈合。以這種方式測量集體細胞遷移，可以重復出在癌癥轉移，胚胎形態發生和組織損傷等一系列生物過程中發生的細胞遷移。
LiveCyte系統可用于活細胞成像，并能對細胞群體和單個細胞行為進行分析。測量的無創性（無標記，低照明功率）確保細胞不受干擾，在長時間內細胞行為更大程度接近自然方式下。不需要圖像拼合就能得到非常大的成像視野。高對比度圖像質量是的能夠對單細胞行為進行表征（形態參數和運動性）。與傳統方法（例如明場，熒光和相差成像）相比，LiveCyte系統能提供更多的參數信息。
方法:
將MDA MB231細胞以5×10 5個細胞/ ml接種在Ibidi培養基 - 插入2孔培養皿（貨號81176）中，通過物理障礙形成細胞間隙。接種后24小時，取出插入物，用空載作為對照（1％BSA \ HBSS），50μM溶血磷脂酸（LPA）處理細胞。 Phasefocus的LiveCyte系統用于對傷口進行延時成像，每10分鐘進行一次成像總共48小時。用Cell Analysis Toolbox 軟件對傷口面積進行分割和測量，并且能夠計算出t1/2(即傷口面積減小一半所用時間)和Vmigration（細胞遷移率）。另外，還能通過對單個細胞進行分割和追蹤收集其動力學和形態學的數據。
圖1 - 使用Phasefocus CAT軟件測量間隙閉合
a）在0,24和48小時以及對照和LPA處理的細胞中使用CAT軟件（藍色輪廓）劃分的傷口間隙的代表性圖像。
b）相對間隙面積
c）在整個延時拍攝中測量的相對干質量。
d）t1 / 2間隙閉合一半的時間
e）從GAP閉合計算的集體遷移。
間隙閉合率是傷口愈合測定中測量的最常見的指標。隨后，可以計算出間隙閉合一半時的時間(t1 / 2)和Vmigration。LiveCyte系統用于精確測定48小時內間隙面積的變化（圖1）。
1a）與對照組相比，加入50μMLPA導致傷口以更快的速率閉合（圖1a，b），間隙閉合一半時（t1 / 2）的時間為21.4小時，Vmigration為5.3μm/小時（對照組（t1 / 2）41.9小時和Vmigration2.5μm/小時），圖1d，e）然而，間隙面積的變化受細胞遷移和細胞增殖二者的影響。因此，重要的是解釋由于細胞增殖而引起的任何變化。由于我們獲得的圖像可以定量，獲得的圖像的定量性質可以確定細胞的光學體積。檢測隨著時間的推移所有細胞的總光學體積進而可以得出細胞生長和增殖的速度。在該實驗中，細胞在50μMLPA處理16小時后細胞增殖速率明顯增加（圖1c），這表明16小時后細胞遷移和增殖都對t1 / 2差距和Vmigration有影響。除了對集體遷移進行建模之外，Livecyte系統的附加功能使得能夠直接測量傷口前端的單個細胞（圖2a）。如此對細胞的的追蹤能夠揭示出50μM LPA處理后細胞平均遷移速率的增長和瞬時細胞遷移速度。LPA處理后實驗組meandering index減少，揭示遷移行為也受到影響（圖2b）。進一步對單個細胞進行多參數分析，例如定量形態參數，如細胞面積，厚度，球形度和長寬比。50μM LPA處理導致細胞厚度和球形度的增加，同時減少了長度/寬度比。
圖2 - 先進單細胞的分割和跟蹤功能a）傷口前緣細胞的代表性圖像
使用Phasefocus CAT軟件在48小時內進行分割和跟蹤。b）
運動性和c）從跟蹤細胞計算出的細胞平均形態學指標。
結論:
在此應用指南中，我們闡述了Phasefocus Livecyte 系統對傷口愈合測定中在成像和數據分析方面的優勢。該檢測的無創性能夠保證在更長的時間區間進行成像因此能夠得到一個更加準確的隨著時間傷口閉合的計量。另外在集體細胞遷移方面，產生高對比度的圖像定量能夠在單細胞水平對多個參數分析，這種單細胞分析在收集細胞形態學方面的信息的同時可以直接計算細胞遷移，能夠對在傷口愈合過程中單個細胞同時進行行為和形態學分析。
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