抗體的純化——抗原配體特異性純化

1. 抗原(抗體/蛋白)特異性親和柱制備

1.1 含氨基配體特異性親和柱的制備

1.1.1 稱取0.3 g溴化*活化的瓊脂糖凝膠（CNBr-activated Sepharose 4B）干粉加入1mM鹽酸中，常溫攪拌至少30min或者4℃過夜使其充分溶漲，0.3g可以獲得1ml溶漲膠。也可直接取1ml NHS活化的瓊脂糖凝膠。

1..12 將凝膠轉移入純化柱中，用約30ml 1mM的HCl抽濾介質3次。抽濾去除內部空氣氣泡。

1.1.3 用5～10倍體積的超純水清洗介質一遍，（留1～2倍體積超純水將凝膠重懸起來）。

1.1.4 將含氨基待偶聯抗原/蛋白用偶聯緩沖液（0.5M NaCl，0.1M NaHCO3，pH8.3）溶解成2mg/ml濃度。

1.1.5 將重懸的凝膠與待偶聯抗原/蛋白-偶聯緩沖液迅速混合，室溫（25℃）反應2h以上，期間不斷搖動，使其充分偶聯反應；

1.1.6 偶聯結束，取上清液檢測是否還有游離未偶聯的配體（蛋白或抗體），檢測方法：用分光光度計直接檢測計算，如果溶液中配體含量＞0.2mg/mL，說明偶聯飽和；否則重復第1.1.4～第1.1.5）步。一般1ml凝膠可以偶聯10mg抗體/蛋白配體。

1.1.7 確認偶聯完全后，取 15ml封閉緩沖液（1M 乙醇胺,0.5M NaCl,pH8.3或0.1M Tris-Cl,pH8.5）室溫(25℃)孵育2h或4 ℃過夜；

1.1.8 交替使用20ml的偶聯緩沖液和20ml的乙酸鹽緩沖液（0.5M NaCl，0.1M HAc-NaAc，pH4）洗凝膠柱4次;

1.1.9 親和柱制備好后，用PBS平衡后即可用于抗體純化；

1.1.10 如若暫不使用，用20%的乙醇（含20% 乙醇，0.02% NaN3的PBS）保存。

1.2 含巰基抗原/多肽特異性親和柱的制備

1.2.1 取適量Sulfolink Beads去掉保護劑，用3倍柱床體積的偶聯緩沖液（50Mm Tris,5mM EDTA-Na,pH8.5）洗滌柱子3次。

1.2.2 將含巰基抗原/多肽用偶聯緩沖液溶解成2mg/ml,加入Sulfolink Beads，室溫(25℃)搖晃孵育2h。

1.2.3 去除步驟1.2.2中的緩沖液，收集檢測；用3倍柱床體積的偶聯緩沖液清洗柱床。

1.2.4 加入等體積的封閉液（50mM Tris-HCl,5mM EDTA-Na,50Mm L-半胱氨酸，Ph8.5）, 室溫(25℃)孵育2h。

1.2.5 柱子用3倍體積的PBS(pH7.4)洗滌3次，可立即使用；如暫不用，可以保存在20%的乙醇（含20% 乙醇，0.02% NaN3的PBS）中。

2. 抗原(抗體/蛋白)特異性親和純化抗體

其純化步驟與Protein A /Protein G/ Protein L親和純化方法相同。