胰腺導管腺癌（PDAC）是致死率最高的實體瘤之一。超過 80% 的 PDAC 患者在接受手術切除后仍會出現疾病復發。免疫檢查點阻斷劑改變了包括黑色素瘤和肺癌在內的實體瘤晚期患者的前景，但只有一小部分 PDAC 患者可能從中受益。PDAC 在免疫學上表現出 "冷"腫瘤微環境（TME），其特點是促進腫瘤的免疫細胞（如髓源抑制細胞（MDSCs））的浸潤，而且通常缺乏 CD8+T 細胞，導致細胞毒性效應功能喪失。近日，復旦大學附屬腫瘤醫院虞先濬/施思教授團隊在Gut上發表了名為《CRIP1 fosters MDSC trafficking and resets tumour microenvironment via facilitating NF-κB/p65 nuclear translocation in pancreatic ductal adenocarcinoma》的文章，利用質譜流式（CyTOF?），組織成像質譜流式（IMC?）等多種不同的技術，研究了PDAC腫瘤細胞在腫瘤免疫微環境（TIME）形成中的機制，并根據基因型異質性為PDAC患者提供潛在的聯合治療策略。

為了探索 PDAC 的微環境及其形成機制，研究者利用 Standard BioTools商品化的17 個marker的腫瘤免疫panel，對 40 例 PDAC 患者的腫瘤標本進行了多參數 IMC? 分析（圖 1A），檢測了腫瘤中的主要的細胞類型，包括 E-cadherin+上皮細胞和 αSMA+成纖維細胞，以及增殖標志物 Ki-67，并檢測到三個免疫細胞亞群：CD3+T細胞、CD68+髓系細胞和CD20+B細胞。在 T 細胞中進一步識別出 CD8+T 細胞、CD4+T 細胞和 Tregs。由于IMC?具有亞細胞級別的分辨率，能夠在空間水平對單細胞進行分析，因此研究者進一步對掃描圖像進行單細胞劃界，并使用 FlowSOM 鑒定出 20 個細胞元群，根據細胞類型特異性標志物的不同表達水平，這 20 個細胞元群被手動合并為7 個細胞群，包括 3 個癌細胞群、6 個成纖維細胞群和 8 個免疫細胞群。鄰域分析表明，這些細胞群之間存在大量的相互作用或回避關系，這進一步表明了 PDAC 微環境中存在著復雜的細胞交流。由此可以看出，利用IMC?技術不僅可以對腫瘤免疫微環境中復雜的細胞亞群進行分析，還能夠在空間水平解析細胞與細胞之間的相互作用關系。由于 CD8+T 細胞反映了免疫微環境的激活情況，作者根據 CD8+T 細胞的浸潤情況將樣本分為兩組然后對這兩組樣本的腫瘤標本進行 RNA 測序分析，對比TCGA的正常組織，發現了差異化的兩個基因， 并選擇了CRIP1 作為進一步研究的對象。

圖1.CRIP1 是一種與與 PDAC 的低免疫激活有關的關鍵促癌蛋白。(A）獲取和分析 40 例 PDAC 標本數據的示意圖。(B) 使用所述標志物的抗體進行染色的代表性圖像。(C）E-cadherin 用于區分上皮細胞，αSMA 用于區分成纖維細胞，Ki-67 用于區分增殖細胞。(D) CD3、CD4 和 CD8 用于表示 T 細胞，CD68 用于表示髓系細胞，CD20 用于表示 B 細胞。(E）通過手動合并 FlowSOM 生成的 20 個元群得到的 7 個細胞群中 15 個標志物強度中位數的熱圖。(F）t-SNE 圖中人工合并得到的 7 個細胞群；t-SNE 圖中 PDAC 樣本細胞中 CD8 的表達。

由于組織成像質譜流式系統具有一機雙模的特點，不僅能夠檢測切片樣本，還能夠對腫瘤樣本的單細胞懸液進行質譜流式（CyTOF?）分析。為了進一步探索 CRIP1 在免疫抑制中的作用，研究者為T細胞和非T細胞分別設計了15 個和 17 個marker的panel，利用CyTOF?技術檢測了20 例患者的新鮮 PDAC 樣本。作者首先對 T 細胞中的標志物表達水平進行了分析，使用 FlowSOM 鑒定出 20 個細胞元群，最終合并得到了 5 個細胞群。之后作者用t-SNE對這些細胞元群、細胞群和代表性標志物的分布進行了可視化（圖2 B-E）。結果顯示，CRIP1 高表達組別的 CD8+T 細胞和 CD4+T 細胞浸潤減少，衰竭標志物 CD279 的表達增加。CD279 表達的增加同時出現在 CD4+T 細胞和 CD8+T 細胞中，這表明 PDAC 中存在廣泛的 T 細胞衰竭。在 CRIP1 高表達的樣本中，一些 CD4+T 細胞的 CD25 表達較高，可能是 Tregs。同時，CD45+CD3-細胞群在 CRIP1 高表達的腫瘤中明顯富集，這表明不同類型的腫瘤在非 T 細胞富集方面存在很大差異。

接下來作者通過 t-SNE 和FlowSOM分析非 T 細胞，鑒定出了 20 個細胞群，并將總細胞群分為 8 個亞群，發現 MDSCs 在 CRIP1 高分組中明顯富集。另外，作者發現， CRIP1 的表達與 PDAC 中 CD8+T 細胞的浸潤呈強負相關，與PDAC中MDSC 的浸潤呈強正相關，而在其他腫瘤中則不然。基于這些結果，CRIP1 在 PDAC 中誘導高 MDSC 浸潤和低 T 細胞浸潤，在 PDAC 免疫微環境中的作用可能比在其他腫瘤中更重要。CRIP1 表達的升高誘導了高水平的髓源性抑制細胞（MDSC）浸潤，并促進了免疫抑制性腫瘤微環境的形成。結合其他的技術手段，研究者進一步探究了具體的機制，發現CRIP1/NF-κB/CXCL 軸對于引發 PDAC 的免疫逃避和 TIME 的形成至關重要。阻斷這一信號通路可阻止 MDSC 的遷移，從而使 PDAC 對免疫療法敏感。

圖2. CRIP1 在 PDAC 微環境中誘導高 MDSC 浸潤和低 T 細胞浸潤。(A）CyTOF? 數據采集示意圖，包括組織制備、抗體染色、上機、數據的聚類和降維。(B) T細胞panel中， FlowSOM 生成的 20 個元群合并得到的 5 個細胞群中15 個標志物的表達熱圖。(C）T細胞panel中，FlowSOM 得到的20個元群的t-SNE結果圖。(D)T細胞panel中，通過人工合并得到的五個細胞群的 t-SNE 結果圖。(E）T 細胞浸潤在 CRIP1 高/低組中的 t-SNE 圖。

在這篇文章中，作者利用組織成像質譜流式系統分析了PDAC腫瘤組織的原位信息和空間分布，為腫瘤組織中微環境提供了全面的視角，并且結合CyTOF?分析技術對細胞的組成和功能進行了進一步的挖掘，從多角度分析了腫瘤的微環境，提高了實驗的深度。另外值得一提的是，在本研究工作中，實驗的順利開展以及研究成果的快速發表，也正是基于質譜流式實驗設計簡單，實驗結果可靠，具有完整的解決方案等特點。同時，更離不開研究者們辛勤的工作，因此也再次對復旦大學附屬腫瘤醫院虞先濬/施思教授團隊表示衷心的祝賀。

參考文獻：

Liu X, Tang R, Xu J, et al. CRIP1 fosters MDSC trafficking and resets tumour microenvironment via facilitating NF-κB/p65 nuclear translocation in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Gut, 2023.