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大家好，這里是只想咕咕的椰球。8月為大家帶來的是一篇來自Cell Reports的研究。論文的標題很好地概括了這篇研究的主要內容，抑制膽堿能中間神經元增強直接通路中等多棘神經元的皮層-紋狀體突觸傳輸從而改善帕金森綜合征動物的運動學習。本文的作者均來自法國的艾克斯－馬賽大學。

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在之前的解讀文章中，我們已經介紹了細胞特異性（cell-type specific）研究在神經環路研究領域的基本思路和手段（具體內容可回顧往期文章：【Cell Reports】細胞特異性研究揭示前島葉皮層VIP中間神經元在適應性行為中的作用）。通過遺傳學等手段，細胞特異性研究可以針對性地關注某一群特征一致的神經元的活動規律和生理功能。而本文的研究者所關注的是紋狀體中膽堿能中間神經元對直接通路中等多棘神經元這一特異性投射在帕金森病中所發揮的作用。因此可以認為本文的研究達到了“投射特異性”水平。

在本文中，作者在離體（腦片）和在體兩個層面，利用光遺傳學、化學遺傳學操縱結合電生理、動物行為學等技術揭示了這條膽堿能投射通路對直接通路中等多棘神經元的突觸傳遞和突觸可塑性的調控作用，暗示膽堿能系統對紋狀體神經元的調控可能依賴于多巴胺輸入的整合。

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引言

本文涉及了紋狀體中兩類不同神經元：膽堿能中間神經元和中等多棘神經元。作為基底神經節的重要輸入結構，紋狀體中占絕對主導地位的是一類名為“中等多棘神經元（medium spiny neurons，MSNs）”的GABA能神經元。MSNs廣泛接受來自于皮層、丘腦的谷氨酸輸入以及來自黑質的多巴胺輸入，并與基底神經節的輸出結構相連參與運動控制（圖 1左）。MSNs可以被分為兩類：膜表面表達Ⅰ型多巴胺受體的D1-MSNs直接投射向黑質網狀部/內側蒼白球等基底神經節的輸出結構，這條投射通路被稱為直接通路（direct pathway），本文中研究的直接通路MSNs就是這類細胞；而表達Ⅱ型多巴胺受體的D2-MSNs則通過外側蒼白球、丘腦底核等核團與基底神經節的輸出結構間接相連，因此被稱為間接通路（indirect pathway）。多巴胺作用于D1-MSNs可以激活其活動但作用于D2-MSNs則會抑制間接通路的活動，直接通路和間接通路依賴于多巴胺調控的活動平衡被認為是基底神經節運動控制的重要基礎（圖 1中）。在帕金森病中，由于黑質中多巴胺神經元大量死亡，缺少多巴胺輸入的兩條通路活動逐漸失衡從而導致運動障礙的發生（圖 1右）。

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圖1 基底神經節環路和帕金森病的經典模型（McGregor and Nelson，2019）

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除了MSNs外，紋狀體中還有少量的GABA能和膽堿能中間神經元。這兩種中間神經元占比都不高（據估計只有1%-2%），它們主要投射向局部的MSNs并對MSNs的活動起到調控作用。在本文中，研究者關注的是紋狀體中的膽堿能中間神經元（cholinergic interneurons，CINs），這類神經元因其以穩定的頻率持續放電也被稱為緊張性發放神經元（tonically active neurons，TANs）。以往的研究顯示，當獎賞或者運動事件出現時CINs的緊張性發放會出現短暫的停頓，研究者普遍認為CINs可以通過這種方式改變紋狀體中乙酰膽堿的濃度從而在運動學習或抉擇中發揮調控作用。然而在帕金森病中，CINs卻失去了通過暫停調控神經活動的能力。本文作者之前的研究發現，使用光遺傳手段在帕金森模型小鼠中抑制CINs活動可以選擇性地影響皮層經直接通路誘發的黑質神經元反應，這提示紋狀體膽堿能神經元對直接通路MSNs的調控作用。然而，CINs向MSNs的膽堿能投射是如何影響皮層-紋狀體信息處理通路的，在帕金森病過程中這種調節作用又會發生怎樣的改變，依然值得進一步探索。

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結果

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為了在操縱紋狀體CINs活動的同時對D1-MSNs進行記錄，研究者首先建立了轉基因工具鼠品系。利用Cre-loxp系統（關于Cre-loxp系統的應用可以參考文章：又見Cre！Cre/Loxp系統應用全攻略 | 知識點分享），研究者將ChAT-cre與Rosa-NpHR鼠雜交從而在膽堿能神經元中特異性表達抑制性光敏蛋白NpHR，然后再與D1-tdTomato鼠雜交從而使得D1-MSNs中特異性表達紅色熒光。

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在急性分離的紋狀體腦片中，研究者使用全細胞膜片鉗方式鉗制表達了紅色熒光的D1-MSNs，并在皮層施加電刺激以誘發MSNs產生突觸后電位，同時使用585 nm光刺激以抑制CINs的活動（圖 2A）。記錄結果表明，在非帕金森鼠的腦片中，光刺激未能顯著改變D1-MSNs的興奮性突觸后電位（excitatory post-synaptic potentials，EPSPs）和配對脈沖比（paired-pulse ratio，PPR）（圖 2B）。然而，在單側注射6-OHDA誘導帕金森模型的工具鼠所制備的腦片中，光刺激時記錄到的誘發的EPSPs的幅度顯著高于無光刺激，然而光照依然未使得PPR表現出顯著變化（圖 2C）。以上發現提示當紋狀體失去多巴胺支配后，短暫抑制CINs活動可以增強直接通路MSNs中皮層-紋狀體的突觸傳輸。

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圖2 6-OHDA模型動物中D1-MSNs皮層-紋狀體EPSPs得到增強

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光照導致EPSPs的幅度增強而PPR未發生改變提示了6-OHDA損傷可能對D1-MSNs突觸后活動產生了影響。因此研究者接下來檢測了特異性表達在D1-MSNs膜上的M4代謝型乙酰膽堿受體（M4 mAChRs）是否參與了膽堿能神經元對MSNs的調控。使用M4 mAChRs的抑制劑托吡卡胺（tropicamide）孵育腦片，研究者發現D1-MSNs中的誘發EPSPs出現了顯著的上升（圖 3A）。同樣地，在托吡卡胺存在的條件下抑制CINs的活動并未對D1-MSNs的誘發EPSPs產生顯著影響（圖 3B），這提示M4 mAChRs可能參與CINs對皮層-紋狀體突觸傳輸的調控。

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下一步，研究者想到由于M4 mAChRs是一種G蛋白偶聯受體，激活Gαi偶聯的M4 mAChRs將會抑制蛋白激酶A（PKA）的活動。因此PKA途徑可能參與了膽堿能神經元對MSNs的突觸后調控。為了驗證這一假說，研究者將PKA的抑制劑（PKI）加載在電極內液中導入D1-MSNs。在電極內液中存在PKI的條件下，EPSPs幅度并未因光抑制CINs而出現上升（圖 3C和3D），提示在帕金森模型鼠中，CINs通過M4 mAChRs及PKA途徑調控皮層-紋狀體的突觸傳輸。

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圖3 在6-OHDA模型鼠中，M4 mAChR和PKA介導了D1-MSNs中光抑制CIN導致的皮層-紋狀體EPSPs的上升

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與此同時，研究者還提出了另外一個問題：為什么在6-OHDA模型鼠中，抑制CINs活動可以導致皮層-紋狀體突出傳輸的改變，而在正常工具鼠中卻檢測不到這種改變？6-OHDA注射可以殺死黑質中的多巴胺能神經元，從而解除對MSNs和CINs的支配，這種改變是否影響了D1-MSNs膜表面M4 mAChR的表達量或者M4 mAChR對乙酰膽堿的親和力？為了探索這個問題，作者分別使用流式熒光分選技術（FACS-sorting）和G蛋白激活的鉀通道（GIRK2）對這兩個問題進行了探索。結果顯示6-OHDA模型鼠中的M4 mAChR的mRNA水平相比健康鼠雖然數值上略高于，但并沒有統計上的區別（圖 3E）。另外M4 mAChR對于內源乙酰膽堿的敏感性也未發生顯著的變化（圖 3F）。因此6-OHDA注射所導致的變化更有可能發生在CINs而不是MSNs上。

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以上結果在腦片上證實了在帕金森模型鼠中光抑制CIN活動可以調控皮層-紋狀體的突觸傳輸。接下來研究者希望通過在體水平的實驗進一步驗證這一現象。首先研究者構建了一套在體誘導MSNs產生長時程增強（long-term potential, LTP）范式。依然采用上文提到過的轉基因工具鼠模型，利用在體胞內記錄手段，研究者對背側紋狀體（主要接受來自感覺運動皮層輸入）細胞進行了記錄。在膜電位的下降相，研究者對細胞注入去極化電流的同時使用短暫的高頻電刺激以誘發LTP的產生（圖 4A）。另外，研究者還檢驗了光刺激對CINs活動的抑制效果，結果表明光照可以強烈抑制紋狀體CINs的放電，而在光照后CINs的活動出現了大幅度的反彈（圖 4B）。

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驗證范式成立后，研究者分別檢測了未損傷、6-OHDA模型和6-OHDA模型+CIN抑制三種情況下MSNs的LTP誘發情況。在未損傷狀態下，高頻電刺激后EPSP斜率隨時間表現出明顯的上升趨勢，提示LTP被成功誘發（圖 4C，灰色）。而在6-OHDA帕金森模型動物中，EPSP斜率完全不隨時間變化，表明在帕金森模型動物中皮層-紋狀體的突觸可塑性遭到破壞（圖 4C，綠色）。最后，在6-OHDA模型動物中使用光抑制CIN活動使得EPSP斜率出現了小幅上升，雖然不及未損傷動物的程度，但是顯著高于無光刺激的模型動物（圖 4C，黃色）。以上結果表明，光抑制CINs活動可以部分恢復帕金森動物中的LTP作用。

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圖4 在帕金森模型鼠中光抑制CIN活動可以部分恢復皮層-紋狀體的在體長時程增強作用

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在本文的最后，研究者檢驗了抑制紋狀體CINs活動對動物行為表型的改變。作為一個高水平的研究，從細胞層面過度到行為層面從而形成研究層次的完整是必需的。為了檢驗抑制CIN對動物運動能力的影響，研究者使用加速轉棒（Rota-Rod）實驗作為運動技巧學習的范式，并且采用化學遺傳的方式對CINs的活動進行了操縱。首先研究者還是在電生理水平驗證了化學遺傳抑制的效果。在ChAT-cre鼠的紋狀體注射cre依賴的受體hM4Di（巧合的是hM4Di正是從乙酰膽堿受體上改造而來），給予CNO后研究者發現CINs的放電頻率出現了顯著的下降，并且可以維持30 min以上（圖 5B）。接下來，作者分別在6-OHDA模型動物的紋狀體注射攜帶了hM4Di或空載的AAV病毒，未損傷的sham動物也在紋狀體注射了含空載體的AAV病毒作為對照（圖 5C）。研究者對這三組動物進行了轉棒實驗的訓練和測試，結果不出意外，注射了對照病毒的6-OHDA模型動物從轉棒上跌落的速度最快，表現出最短的掉棒潛伏期（latency to fall）。而未損傷動物則表現出最長的掉棒潛伏期，雖然只有150 s（圖5D，灰色）。而在轉棒測試前給予CNO化學遺傳抑制CINs活動使得動物的掉棒潛伏期顯著高于6-OHDA模型鼠（圖5D，黃色）。以上結果表明抑制CINs活動可以改善帕金森模型鼠的運動學習能力，這與上文電生理記錄的結果是一致的。

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圖5 在6-OHDA誘導的帕金森模型動物中使用化學遺傳抑制CINs活動可以增強動物的運動技巧學習能力

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尾聲

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本文雖然篇幅不長（只有四個figure），但是基本遵循了我們之前所提到的環路研究思路（由于是投射特異性研究，本文不需要示蹤實驗，但是記錄和操縱實驗貫穿始終），內容扎實，從細胞到行為水平一應俱全。尤其是研究者在腦片和在體研究中所采用的范式難度不小，體現出了研究者高超的電生理功底。當然不可否認的是，作者在主要研究內容中依然未能解答6-OHDA損傷是如何改變紋狀體CINs-MSNs環路從而導致調控模式產生變化的這一問題。雖然我們可以推測這一改變與多巴胺系統的缺失有著千絲萬縷的聯系，但是其具體路徑依然非常值得關注。

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參考文獻

[1] McGregor M M, Nelson A B. Circuit mechanisms of Parkinson’s disease[J]. Neuron, 2019, 101(6): 1042-1056.