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? ? ? ?帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是除了阿爾茨海默病之外，世界第二大的神經(jīng)退行性疾病。為了紀(jì)念發(fā)現(xiàn)這一疾病的英國(guó)醫(yī)生詹姆斯·帕金森，人們將他的生日——4月11日確定為“世界帕金森日”。
? ? ? ?帕金森病的主要癥狀表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)障礙，如運(yùn)動(dòng)遲緩（bradykinesia）、僵直（rigidity）、靜止性震顫（tremor）等。除此之外帕金森患者也表現(xiàn)出了感覺(jué)障礙和認(rèn)知功能障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀。一項(xiàng)2016年的研究顯示，60歲以上老年人群中帕金森病的患病率約為1%-2%；而在80歲以上人群中，這一比例則會(huì)上升至4%左右1。目前，我國(guó)的帕金森患者已經(jīng)達(dá)到了200萬(wàn)人，占全世界帕金森病人的一半左右。在我國(guó)老齡化逐步加深的背景下，帕金森病已經(jīng)成為威脅老年人群身心健康的一大“殺手”。
? ? ? 帕金森病最為突出的病理改變是中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的變性和死亡。另外人們發(fā)現(xiàn)，殘存神經(jīng)元中路易小體的形成和α-突觸核蛋白的聚集也是帕金森病的典型特征之一。帕金森病的病因至今未明，證據(jù)顯示遺傳、環(huán)境污染、衰老等因素均在帕金森病的發(fā)生中扮演了一定的角色。
? ? ? 為了研究帕金森病的發(fā)病原因以及探索新的臨床的治療手段，制備有效的帕金森病動(dòng)物模型有著重要的意義。在本文中我們將介紹3種主流的帕金森病的動(dòng)物模型的原理和制備方法。而在下期，我們將介紹檢驗(yàn)大小鼠帕金森模型造模效果的病理和行為學(xué)方法。
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? ? ? ?1982年，7個(gè)來(lái)自加利福尼亞州圣克拉拉縣的“嬉皮士”在吸食了一種合成毒品后被緊急送往醫(yī)院救治。醫(yī)生驚奇地發(fā)現(xiàn)，這7位患者雖然年紀(jì)輕輕，行動(dòng)卻像百歲老人一樣遲緩，并伴隨有肢體震顫的現(xiàn)象，和帕金森病的表現(xiàn)十分相似。進(jìn)一步的檢驗(yàn)表明，這批合成毒品中含有一種名為1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP）的雜質(zhì)2。1984年，斯坦福大學(xué)的神經(jīng)學(xué)家威廉·蘭斯頓確認(rèn)MPTP正是導(dǎo)致這些年輕人出現(xiàn)帕金森樣癥狀的罪魁禍?zhǔn)?sup>3。
? ? ? ?從原理來(lái)看，MPTP本身對(duì)細(xì)胞并無(wú)毒害作用。但是當(dāng)MPTP進(jìn)入體內(nèi)后，由于自身良好的脂溶性，MPTP可以輕易穿過(guò)血腦屏障（blood-brain barrier, BBB）進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)4。而在腦中，MPTP會(huì)被神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的單胺氧化酶B（MAO-B）代謝為一種名為MPDP +的中間體。而該中間體再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的氧化，最終形成有毒的代謝物甲基-苯基四氫吡啶鎓鹽（MPP +）5。
? ? ? ?MPP+的結(jié)構(gòu)接近多巴胺，因此會(huì)錯(cuò)誤地被中腦多巴胺神經(jīng)元膜上的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（dopamine transporter, DAT）選擇性重吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)6。而一旦進(jìn)入細(xì)胞，MPP+則會(huì)“兇相畢露”，它會(huì)抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體I的活性7，從而阻斷電子轉(zhuǎn)移鏈，減少ATP的生成并促進(jìn)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，最終造成神經(jīng)元的損傷8。
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圖1 MPTP的代謝途徑和MPP+在胞內(nèi)的路徑
? ? ? ?正因?yàn)镸PTP是第一個(gè)也是目前僅能夠在人類(lèi)身上復(fù)現(xiàn)帕金森癥狀的神經(jīng)毒素（某種意義上還要感謝這幾位加州的年輕人），MPTP誘導(dǎo)的帕金森模型成為了在模式動(dòng)物上研究帕金森病臨床療法的“金標(biāo)準(zhǔn)”，尤其是MPTP誘導(dǎo)的非人靈長(zhǎng)類(lèi)（如恒河猴）帕金森模型。而MPTP誘導(dǎo)的小鼠帕金森模型由于造模技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單（只需要腹腔注射）、對(duì)多巴胺神經(jīng)元的殺傷效果穩(wěn)定也得到了廣泛的認(rèn)可。不少關(guān)于多巴胺能神經(jīng)元死亡機(jī)制方面的研究都采用MPTP誘導(dǎo)的小鼠帕金森模型作為實(shí)驗(yàn)范式。
? ? ? ?動(dòng)物：雄性C57BL/6，大約7-8周齡，體重25-30 g。注意MPTP誘導(dǎo)的小鼠帕金森模型對(duì)動(dòng)物的性別、體重、年齡甚至品系來(lái)源（是Jackson lab還是Charles River）均非常敏感。在挑選動(dòng)物的時(shí)候要十分小心。
? ? ? ?飼養(yǎng)：訂購(gòu)的動(dòng)物到位后，在注射前務(wù)必適應(yīng)性飼養(yǎng)1周左右。因?yàn)殚L(zhǎng)距離運(yùn)輸會(huì)改變腦的狀態(tài)，因此需要5-7天時(shí)間來(lái)使動(dòng)物恢復(fù)并適應(yīng)環(huán)境。
? ? ? ?注射：在注射當(dāng)天配制好新鮮的MPTP溶液，然后每只動(dòng)物按14-20 mg/kg體重的劑量腹腔注射MPTP。間隔2小時(shí)后進(jìn)行下一次注射，當(dāng)天共進(jìn)行4次注射。
? ? ? ?術(shù)后護(hù)理：注射之后大約30分鐘，小鼠就會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似帕金森的癥狀，如強(qiáng)直或震顫等。而在大約3小時(shí)后未被代謝的MPTP將會(huì)隨著動(dòng)物的排泄物被釋放到墊料中。因此在注射之后小鼠需要進(jìn)行嚴(yán)格的隔離飼養(yǎng)。其使用的墊料、飲水必須經(jīng)過(guò)無(wú)害化處理，然后作為醫(yī)療垃圾廢棄。大約3-4周后可以對(duì)動(dòng)物的病理和行為表現(xiàn)進(jìn)行檢測(cè)。
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? ? ? ?6-羥多巴胺（6-hydroxydopamine, 6-OHDA）是多巴胺的羥基化衍生物，于1959年首先被Senoh等人成功分離9。自發(fā)現(xiàn)以來(lái)的半個(gè)多世紀(jì)中，6-OHDA一直在帕金森病的臨床前研究中扮演著重要角色。由Ungerstedt和Arbuthnott在1970年共同創(chuàng)立的單側(cè)注射旋轉(zhuǎn)模型成為了在模式動(dòng)物上被最為廣泛使用的帕金森模型之一10。 6-OHDA對(duì)神經(jīng)元的毒害作用有一個(gè)“兩步走”的過(guò)程。第一步是特異性地在多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)的積累。由于6-OHDA的結(jié)構(gòu)和兒茶酚胺類(lèi)似，因此釋放在細(xì)胞間質(zhì)中的6-OHDA會(huì)被多巴胺神經(jīng)元胞體或突起上的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體或NAT錯(cuò)誤地識(shí)別并重吸收進(jìn)入細(xì)胞（圖2）。第二步則是細(xì)胞毒性。當(dāng)6-OHDA進(jìn)入神經(jīng)元后，一方面將會(huì)被單胺氧化酶-A（MAO-A）催化形成過(guò)氧化氫（H2O2）。過(guò)氧化氫本身具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，同時(shí)也會(huì)觸發(fā)氧自由基的形成12。而另一方面，自動(dòng)氧化（autooxidation）作用所大量產(chǎn)生的活性氧和醌類(lèi)產(chǎn)物超出了細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的承受能力，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝的紊亂，最終結(jié)果就是神經(jīng)元的損傷（圖2）。
圖2 6-OHDA介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用機(jī)制
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? ? ?術(shù)后護(hù)理：腦定位注射完成后將動(dòng)物放在加熱板或燈光下照射保持體溫。待動(dòng)物蘇醒后放回籠中。術(shù)后3天內(nèi)每天腹腔注射一次抗生素。大約3-4周后可以進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。
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? ? ? ?除了多巴胺神經(jīng)元丟失之外，帕金森病的另一種典型的神經(jīng)病理標(biāo)志是殘存的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)一種嗜酸性的包涵體，即路易小體（Lewy bodies, LBs）。顯微鏡下呈現(xiàn)圓形的粉紅色均質(zhì)結(jié)構(gòu)。路易小體的主要組成成分是一種叫做α-突觸核蛋白（α-synuclein, α-Syn）的突觸前蛋白。大量證據(jù)顯示，α-突觸核蛋白的聚集和路易小體的形成與多巴胺神經(jīng)元的死亡有著密切的聯(lián)系13。α-突觸核蛋白由SNCA基因編碼，是一種主要表達(dá)在突觸前和核周的可溶性蛋白。α-突觸核蛋白的確切功能至今仍不清楚，不過(guò)有證據(jù)顯示可能與突觸可塑性或神經(jīng)遞質(zhì)釋放相關(guān)。正常狀態(tài)下的α-突觸核蛋白以單體（monomers）或者α螺旋狀（α-helical）折疊的四聚體形式存在，可溶并且鮮有聚集的情況；但在病理狀態(tài)下，α-突觸核蛋白會(huì)改變構(gòu)象為富含β片狀（β-sheet）折疊的結(jié)構(gòu)。錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白會(huì)聚集起來(lái)形成寡聚體，并逐漸向纖維原和不溶性纖維的形態(tài)發(fā)展，最終沉積在路易小體中。除此之外，大量研究證據(jù)表明，錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白可以表現(xiàn)出朊病毒（prion）的性質(zhì)，誘發(fā)內(nèi)源α-突觸核蛋白的錯(cuò)誤折疊和聚集，并通過(guò)細(xì)胞間傳遞的方式在神經(jīng)元之間擴(kuò)散。 相比于使用神經(jīng)毒素殺傷多巴胺神經(jīng)元的帕金森模型，基于α-突觸核蛋白的帕金森病模型由于在時(shí)程上能夠較好地模擬帕金森病發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程，這有利于發(fā)現(xiàn)和識(shí)別新的治療靶點(diǎn)。在諸多基于α-突觸核蛋白的帕金森模型中，近年來(lái)被最廣泛使用的模型可以歸納為2種：預(yù)制纖維（pre-performed fibrils, PFFs）和AAV病毒顆粒模型。使用α-突觸核蛋白的預(yù)制纖維進(jìn)行造模首先需要制備PFFs。簡(jiǎn)而言之，預(yù)制纖維首先在體外由重組的α-突觸核蛋白單體生成。接下來(lái)，聚集成原纖維的α-突觸核蛋白被提取出來(lái)并超聲破碎為短纖維的形式14。使用腦立體定位注射的方式將PFFs注射進(jìn)腦內(nèi)，在大約12周后將會(huì)誘發(fā)內(nèi)源α-突觸核蛋白的聚集、磷酸化和泛素化反應(yīng)。 另一種有效的方式是使用重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）外源過(guò)表達(dá)野生型或點(diǎn)突變型（如A53T）α-突觸核蛋白。值得注意的的是，構(gòu)建AAV載體采用的血清型和啟動(dòng)子，以及病毒注射的滴度和劑量都會(huì)對(duì)α-突觸核蛋白過(guò)表達(dá)的效率產(chǎn)生影響15。目前的研究顯示，使用常用的CMV或者h(yuǎn)Syn啟動(dòng)子均可以提供高水平的基因表達(dá)效率。另外，使用一些轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，如土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列（WPRE）或者poly(A)尾巴同樣可以顯著提高轉(zhuǎn)基因的效率。
? ? ? ?動(dòng)物：6-8周齡的C57/BL小鼠或PD相關(guān)的轉(zhuǎn)基因鼠，雌雄不限，體重20-25 g左右。
? ? ? ?飼養(yǎng)：動(dòng)物訂購(gòu)之后需要至少適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后再進(jìn)行腦定位注射。
? ? ? ?腦定位注射：使用10 μL，33G的Hamilton注射器預(yù)先吸入2.5 μL左右α-突觸核蛋白PFFs，其中α-突觸核蛋白纖維的含量約為5 μg。動(dòng)物開(kāi)顱和調(diào)平操作于6-OHDA注射一致。α-突觸核蛋白通常被單側(cè)注射在紋狀體（AP +0.2 mm; ML ±2.00 mm; DV -2.60 mm）。注射針緩慢插入注射位點(diǎn)，以0.1 μL/min的速度將PFFs注射到目標(biāo)腦區(qū)。注射結(jié)束后，注射針應(yīng)該繼續(xù)停留在注射位點(diǎn)5分鐘左右以使纖維充分?jǐn)U散。最后提起注射針，將動(dòng)物的頭皮縫合并消毒。 如果是病毒注射，則構(gòu)建AAV2/1-A53T(人類(lèi)α-突觸核蛋白A53T點(diǎn)突變型)-EGFP-WPRE病毒載體，用注射器或玻璃電極吸取1.5 μL，滴度為2-3×1012 v.g./mL病毒，并以0.1 μL/min的速度單側(cè)注射在黑質(zhì)（AP -3.1 mm; ML -1.4 mm; DV -4.4 mm）。
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? ? ? ?術(shù)后護(hù)理：腦定位注射完成后將動(dòng)物放在加熱板或燈光下照射保持體溫。待動(dòng)物蘇醒后放回籠中。術(shù)后3天內(nèi)每天腹腔注射一次抗生素。大約90天后動(dòng)物會(huì)逐漸表現(xiàn)出帕金森表型。
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