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? ? ? ?帕金森?。≒arkinson’s disease, PD）是除了阿爾茨海默病之外，世界第二大的神經退行性疾病。為了紀念發現這一疾病的英國醫生詹姆斯·帕金森，人們將他的生日——4月11日確定為“世界帕金森日”。

? ? ? ?帕金森病的主要癥狀表現為運動障礙，如運動遲緩（bradykinesia）、僵直（rigidity）、靜止性震顫（tremor）等。除此之外帕金森患者也表現出了感覺障礙和認知功能障礙等非運動癥狀。一項2016年的研究顯示，60歲以上老年人群中帕金森病的患病率約為1%-2%；而在80歲以上人群中，這一比例則會上升至4%左右¹。目前，我國的帕金森患者已經達到了200萬人，占全世界帕金森病人的一半左右。在我國老齡化逐步加深的背景下，帕金森病已經成為威脅老年人群身心健康的一大“殺手”。

? ? ? 帕金森病最為突出的病理改變是中腦黑質中多巴胺能神經元的變性和死亡。另外人們發現，殘存神經元中路易小體的形成和α-突觸核蛋白的聚集也是帕金森病的典型特征之一。帕金森病的病因至今未明，證據顯示遺傳、環境污染、衰老等因素均在帕金森病的發生中扮演了一定的角色。

? ? ? 為了研究帕金森病的發病原因以及探索新的臨床的治療手段，制備有效的帕金森病動物模型有著重要的意義。在本文中我們將介紹3種主流的帕金森病的動物模型的原理和制備方法。而在下期，我們將介紹檢驗大小鼠帕金森模型造模效果的病理和行為學方法。

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? ? ? ?1982年，7個來自加利福尼亞州圣克拉拉縣的“嬉皮士”在吸食了一種合成毒品后被緊急送往醫院救治。醫生驚奇地發現，這7位患者雖然年紀輕輕，行動卻像百歲老人一樣遲緩，并伴隨有肢體震顫的現象，和帕金森病的表現十分相似。進一步的檢驗表明，這批合成毒品中含有一種名為1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP）的雜質²。1984年，斯坦福大學的神經學家威廉·蘭斯頓確認MPTP正是導致這些年輕人出現帕金森樣癥狀的罪魁禍首³。

? ? ? ?從原理來看，MPTP本身對細胞并無毒害作用。但是當MPTP進入體內后，由于自身良好的脂溶性，MPTP可以輕易穿過血腦屏障（blood-brain barrier, BBB）進入中樞神經系統⁴。而在腦中，MPTP會被神經膠質細胞中的單胺氧化酶B（MAO-B）代謝為一種名為MPDP +的中間體。而該中間體再經過進一步的氧化，最終形成有毒的代謝物甲基-苯基四氫吡啶鎓鹽（MPP +）⁵。

? ? ? ?MPP+的結構接近多巴胺，因此會錯誤地被中腦多巴胺神經元膜上的多巴胺轉運體（dopamine transporter, DAT）選擇性重吸收進入細胞內⁶。而一旦進入細胞，MPP+則會“兇相畢露”，它會抑制線粒體呼吸鏈復合體I的活性⁷，從而阻斷電子轉移鏈，減少ATP的生成并促進活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生，最終造成神經元的損傷⁸。

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圖1 MPTP的代謝途徑和MPP+在胞內的路徑

? ? ? ?正因為MPTP是第一個也是目前僅能夠在人類身上復現帕金森癥狀的神經毒素（某種意義上還要感謝這幾位加州的年輕人），MPTP誘導的帕金森模型成為了在模式動物上研究帕金森病臨床療法的“金標準”，尤其是MPTP誘導的非人靈長類（如恒河猴）帕金森模型。而MPTP誘導的小鼠帕金森模型由于造模技術相對簡單（只需要腹腔注射）、對多巴胺神經元的殺傷效果穩定也得到了廣泛的認可。不少關于多巴胺能神經元死亡機制方面的研究都采用MPTP誘導的小鼠帕金森模型作為實驗范式。
? ? ? ?動物：雄性C57BL/6，大約7-8周齡，體重25-30 g。注意MPTP誘導的小鼠帕金森模型對動物的性別、體重、年齡甚至品系來源（是Jackson lab還是Charles River）均非常敏感。在挑選動物的時候要十分小心。
? ? ? ?飼養：訂購的動物到位后，在注射前務必適應性飼養1周左右。因為長距離運輸會改變腦的狀態，因此需要5-7天時間來使動物恢復并適應環境。
? ? ? ?注射：在注射當天配制好新鮮的MPTP溶液，然后每只動物按14-20 mg/kg體重的劑量腹腔注射MPTP。間隔2小時后進行下一次注射，當天共進行4次注射。
? ? ? ?術后護理：注射之后大約30分鐘，小鼠就會出現類似帕金森的癥狀，如強直或震顫等。而在大約3小時后未被代謝的MPTP將會隨著動物的排泄物被釋放到墊料中。因此在注射之后小鼠需要進行嚴格的隔離飼養。其使用的墊料、飲水必須經過無害化處理，然后作為醫療垃圾廢棄。大約3-4周后可以對動物的病理和行為表現進行檢測。

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? ? ? ?6-羥多巴胺（6-hydroxydopamine, 6-OHDA）是多巴胺的羥基化衍生物，于1959年首先被Senoh等人成功分離⁹。自發現以來的半個多世紀中，6-OHDA一直在帕金森病的臨床前研究中扮演著重要角色。由Ungerstedt和Arbuthnott在1970年共同創立的單側注射旋轉模型成為了在模式動物上被最為廣泛使用的帕金森模型之一¹⁰。 6-OHDA對神經元的毒害作用有一個“兩步走”的過程。第一步是特異性地在多巴胺能神經元內的積累。由于6-OHDA的結構和兒茶酚胺類似，因此釋放在細胞間質中的6-OHDA會被多巴胺神經元胞體或突起上的多巴胺轉運體或NAT錯誤地識別并重吸收進入細胞（圖2）。第二步則是細胞毒性。當6-OHDA進入神經元后，一方面將會被單胺氧化酶-A（MAO-A）催化形成過氧化氫（H2O2）。過氧化氫本身具有很強的細胞毒性，同時也會觸發氧自由基的形成¹²。而另一方面，自動氧化（autooxidation）作用所大量產生的活性氧和醌類產物超出了細胞內抗氧化酶的承受能力，導致細胞結構和代謝的紊亂，最終結果就是神經元的損傷（圖2）。

圖2 6-OHDA介導的神經毒性作用機制

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? ? ?術后護理：腦定位注射完成后將動物放在加熱板或燈光下照射保持體溫。待動物蘇醒后放回籠中。術后3天內每天腹腔注射一次抗生素。大約3-4周后可以進行行為學檢測。

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? ? ? ?除了多巴胺神經元丟失之外，帕金森病的另一種典型的神經病理標志是殘存的神經元胞質內出現一種嗜酸性的包涵體，即路易小體（Lewy bodies, LBs）。顯微鏡下呈現圓形的粉紅色均質結構。路易小體的主要組成成分是一種叫做α-突觸核蛋白（α-synuclein, α-Syn）的突觸前蛋白。大量證據顯示，α-突觸核蛋白的聚集和路易小體的形成與多巴胺神經元的死亡有著密切的聯系¹³。α-突觸核蛋白由SNCA基因編碼，是一種主要表達在突觸前和核周的可溶性蛋白。α-突觸核蛋白的確切功能至今仍不清楚，不過有證據顯示可能與突觸可塑性或神經遞質釋放相關。正常狀態下的α-突觸核蛋白以單體（monomers）或者α螺旋狀（α-helical）折疊的四聚體形式存在，可溶并且鮮有聚集的情況；但在病理狀態下，α-突觸核蛋白會改變構象為富含β片狀（β-sheet）折疊的結構。錯誤折疊的α-突觸核蛋白會聚集起來形成寡聚體，并逐漸向纖維原和不溶性纖維的形態發展，最終沉積在路易小體中。除此之外，大量研究證據表明，錯誤折疊的α-突觸核蛋白可以表現出朊病毒（prion）的性質，誘發內源α-突觸核蛋白的錯誤折疊和聚集，并通過細胞間傳遞的方式在神經元之間擴散。 相比于使用神經毒素殺傷多巴胺神經元的帕金森模型，基于α-突觸核蛋白的帕金森病模型由于在時程上能夠較好地模擬帕金森病發生、發展的全過程，這有利于發現和識別新的治療靶點。在諸多基于α-突觸核蛋白的帕金森模型中，近年來被最廣泛使用的模型可以歸納為2種：預制纖維（pre-performed fibrils, PFFs）和AAV病毒顆粒模型。使用α-突觸核蛋白的預制纖維進行造模首先需要制備PFFs。簡而言之，預制纖維首先在體外由重組的α-突觸核蛋白單體生成。接下來，聚集成原纖維的α-突觸核蛋白被提取出來并超聲破碎為短纖維的形式¹⁴。使用腦立體定位注射的方式將PFFs注射進腦內，在大約12周后將會誘發內源α-突觸核蛋白的聚集、磷酸化和泛素化反應。 另一種有效的方式是使用重組腺相關病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）外源過表達野生型或點突變型（如A53T）α-突觸核蛋白。值得注意的的是，構建AAV載體采用的血清型和啟動子，以及病毒注射的滴度和劑量都會對α-突觸核蛋白過表達的效率產生影響¹⁵。目前的研究顯示，使用常用的CMV或者hSyn啟動子均可以提供高水平的基因表達效率。另外，使用一些轉錄后調控元件，如土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節序列（WPRE）或者poly(A)尾巴同樣可以顯著提高轉基因的效率。
? ? ? ?動物：6-8周齡的C57/BL小鼠或PD相關的轉基因鼠，雌雄不限，體重20-25 g左右。
? ? ? ?飼養：動物訂購之后需要至少適應性飼養1周后再進行腦定位注射。
? ? ? ?腦定位注射：使用10 μL，33G的Hamilton注射器預先吸入2.5 μL左右α-突觸核蛋白PFFs，其中α-突觸核蛋白纖維的含量約為5 μg。動物開顱和調平操作于6-OHDA注射一致。α-突觸核蛋白通常被單側注射在紋狀體（AP +0.2 mm; ML ±2.00 mm; DV -2.60 mm）。注射針緩慢插入注射位點，以0.1 μL/min的速度將PFFs注射到目標腦區。注射結束后，注射針應該繼續停留在注射位點5分鐘左右以使纖維充分擴散。最后提起注射針，將動物的頭皮縫合并消毒。 如果是病毒注射，則構建AAV2/1-A53T(人類α-突觸核蛋白A53T點突變型)-EGFP-WPRE病毒載體，用注射器或玻璃電極吸取1.5 μL，滴度為2-3×1012 v.g./mL病毒，并以0.1 μL/min的速度單側注射在黑質（AP -3.1 mm; ML -1.4 mm; DV -4.4 mm）。

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? ? ? ?術后護理：腦定位注射完成后將動物放在加熱板或燈光下照射保持體溫。待動物蘇醒后放回籠中。術后3天內每天腹腔注射一次抗生素。大約90天后動物會逐漸表現出帕金森表型。

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