HRP快速標記試劑盒使用前準備
一、標記前準備
1. 抗體預處理
o 透析或超濾去除抗體溶液中甘油、疊氮鈉、Tris、甘氨酸、EDTA等干擾物（若存在），推薦使用0.01 M pH 7.4 PBS緩沖液透析。
o 調整抗體濃度至 2 mg/mL（常用范圍2-10 mg/mL）。
o 小分子標記需確保HRP過量，標記后透析去除未結合分子。
2. 試劑盒準備
o 提前30分鐘從2-8℃取出試劑盒，室溫平衡。
o 按說明書操作使用。
二、標記步驟（以常見試劑盒為例）
方案A：快速標記法
1. 混合反應
o 抗體溶液中加入1/10體積標記緩沖液，混勻。
o 加入等質量的活化HRP（如1 mg抗體:1 mg HRP），吹打混勻避氣泡1。
o 室溫避光反應 60–120分鐘。
2. 終止反應
o 每10 μL反應液加入1 μL終止液（如2.5 mg/mL硼氫化鈉）。
o 室溫避光靜置30–60分鐘。
方案B：高碘酸鈉氧化法（傳統）
1. HRP氧化
o 溶解NaIO?（20 mg/mL），與HRP溶液等體積混合（如200 μL HRP + 200 μL NaIO?）。
o 4℃避光反應30分鐘（溶液變綠）。
2. 終止氧化
o 加入乙二醇溶液（4 μL乙二醇+40 μL水），4℃避光30分鐘（溶液變褐）。
3. 交聯抗體
o 將氧化HRP加入透析后的抗體中，4℃避光反應4小時。
4. 還原穩定
o 加入NaBH?溶液（0.2 mg/mL），4℃反應1小時。
三、純化與保存
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步驟 |
操作要求 |
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純化 |
4℃ PBS透析過夜去除游離分子（或使用超濾/脫鹽柱）；或采用酶標純化劑（30分鐘完成）。 |
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保存 |
加入等體積甘油，分裝后 -20℃避光保存（避免反復凍融）。 |
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有效期 |
濃標記物可保存1–2年，稀釋后需12小時內使用。 |
四、關鍵注意事項
1. 緩沖環境
o 標記反應需嚴格在說明書指定pH緩沖液（如pH 9.6碳酸鹽或pH 7.4 PBS）中進行。
2. 避光操作
o HRP光照易失活，全程需避光。
3. 試劑新鮮度
o 終止液需現配現用，氧化劑NaIO?避免分解。
4. 比例控制
o 抗體質量比通常為 1:1，需根據試劑盒說明調整。
不同試劑盒操作細節可能略有差異，具體請以產品說明書為準。