蛋白序列分析是指解析蛋白質分子的氨基酸序列，從而揭示蛋白質的結構。這一過程不僅僅是對蛋白質分子進行簡單的結構描述，更是深入了解蛋白質功能、相互作用、疾病機制以及藥物靶點的重要途徑。蛋白質各種各樣，每個蛋白質都有自己特定的三維結構，每個結構都有特定的功能。蛋白質的功能依賴于其結構，而結構由氨基酸序列決定。因此，理解和測定氨基酸序列對于研究蛋白質功能和表達至關重要。例如鐮刀型細胞貧血?。ㄒ?beta;-肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸所代替，構成鐮狀血紅蛋白，取代了正常血紅蛋白）。蛋白序列分析可以幫助科研人員確定未知蛋白的氨基酸組成，識別蛋白質的翻譯后修飾，并揭示其空間結構與功能之間的關系。例如，蛋白質的序列以及N/C端對蛋白合成和過表達都有重要的意義：（1）在蛋白質合成過程中，蛋白質的半衰期與多肽鏈N-端特異的氨基酸有關，它們對蛋白質的壽命有控制作用。并且N端可發生多種翻譯后修飾（例如組蛋白的N端尾巴），這些也與蛋白質的功能和穩定性息息相關。（2）在蛋白表達時，可能會受到外肽酶影響，從而表達的蛋白N/C端會有部分氨基酸缺失。此外，蛋白序列分析在生物醫藥、疾病診斷、靶向治療、抗體藥物開發、疫苗設計等領域都有著廣泛的應用。例如，在藥物開發領域，蛋白序列的分析檢測可用于驗證重組蛋白藥物的純度和穩定性，確保藥物的安全性和有效性；在疾病研究中，通過對異常表達或突變的蛋白進行序列分析，能夠揭示疾病發生發展的分子機制，為精準醫療提供有力支持。
一、蛋白序列分析檢測方法
1、Edman降解法
埃德曼降解法（Edman degradation method）是蛋白質或肽的氨基末端分析法之一，也是常規方法。通過Edman降解法分析N端的15個氨基酸序列在生物藥申報時通常是必檢項目；同時也是很多已上市生物藥的年檢項目。
Edman的大致流程為：在弱堿性條件下使之與異硫氰酸苯酯反應，然后用酸處理，從多肽鏈上僅使氨基末端殘基以氨基酸的苯基乙內酰硫脲衍生物的形態游離出來，然后進行分析（常規是液相），剩余的肽段進行下一步循環反應。根據反應試劑或衍生物的縮寫，本法亦稱PTC法或PTH法。
利用Edman降解法一次能連續測出50-60個氨基酸序列，其優點是：①可以準確分析N端氨基酸序列，特別是能辨別異亮氨酸和亮氨酸、谷氨酰胺和賴氨酸；②靈敏度高；③可靠直接，和質譜法相比較不依賴于數據庫。
當然，Edman降解法也有一定的局限性，例如：通量較低，一個循環只能測一個氨基酸；N端被修飾封閉時，無法直接測序，需要先除去這些基團，才能測序；不能直接測試含二硫鍵的半胱氨酸的序列等。
圖1. Edman降解法流程
2、質譜法
除了Edman降解法，質譜技術（尤其是串聯質譜）也被廣泛用于蛋白質的氨基酸序列分析，具有高通量的特點。質譜法將蛋白酶切成長短不一的肽段（常規在5-30個氨基酸），隨即通過LC-MS/MS分析檢測，將采集的數據與理論序列數據庫進行匹配，進而確認N端序列，質譜可以測出封閉和修飾的蛋白N末端。
一般來說，如果多肽鏈只斷裂成兩段或者三段便能測出它們的氨基酸序列，也就不難推斷出在原來多肽中的前后次序，只要知道原多肽鏈的C端和N端的氨基酸即可，除非末端殘基恰好與切口的氨基酸一樣才不能得出結論。然而多數場合，斷裂得到的肽段多于此數目，因此除了能確定N/C端的肽段位置外，中間那些肽段的次序還是不能肯定。為此，需要用兩種或兩種以上的不同方法斷裂多肽樣本，使其成兩套或者幾套的肽段。不同斷裂的方法是指斷裂的專一性不同（酶不同），即切口是彼此錯位的，因為多套肽段可以互相跨過切口而重疊（overlap），這種跨過切口而重疊的肽段稱為重疊肽（overlaping peptide）。
借助重疊肽可以確定肽段在原多肽鏈中的正確次序，拼湊出整個多肽鏈的氨基酸序列。同時，多套肽段可以互相核對各個肽段的氨基酸序列測定中是否有差錯。此方法的過程即是氨基酸全序列重建的過程。如果有數據庫參考，可驗證蛋白與理論序列的一致性。在分離出一些新的蛋白，沒有理論序列參考的時候，也可以使用此方法獲得蛋白的一級序列信息，這個也就是蛋白的從頭測序（De Novo）。由于質譜法簡便快捷通量高，已成為首選的全長測序方法。
圖2
二、百泰派克生物科技蛋白序列分析項目
1、項目文章一（N端測序）
標題：Phage defence system CBASS is regulated by a prokaryotic E2 enzyme that imitates the ubiquitin pathway
噬菌體防御系統CBASS由一種模擬泛素途徑的原核E2酶調節
期刊：Nature microbiology
IF：20.5
時間：2024
研究概要：
基于環寡核苷酸的抗噬菌體信號系統（CBASS）是一種先天性原核免疫系統。CBASS由環GMP-AMP合成酶（cGAS）和CBASS相關蛋白組成，利用環寡核苷酸激活抗病毒免疫。一類主要的CBASS含有真核泛素結合酶的同源物，它要么是E1-E2的融合，要么是單一的E2。然而，單個E2在CBASS中的功能尚不明確。通過生化、遺傳、低溫電鏡和質譜分析，發現粘質沙雷氏菌的E2酶通過模仿泛素化級聯來調節cGAS。這包括cGAS C末端的加工，cGAS與半胱氨酸殘基的偶聯，cGAS與賴氨酸殘基的連接，異肽鍵的裂解和多cGASylation。多cGASylation激活cGAS產生cGAMP， cGAMP作為抗病毒信號并導致細胞死亡。因此，研究結果揭示了E2在CBASS中的獨特調節作用。
其中基于Edman降解法的N端測定由百泰派克提供。
圖3
2、項目文章二（N/C端測序）
標題：Bioengineered Human Serum Albumin Fusion Protein as Target/Enzyme/pH Three-Stage Propulsive Drug Vehicle for Tumor Therapy
生物工程人血清白蛋白融合蛋白作為腫瘤治療的靶標/酶/pH三期推進藥物載體
期刊：ACS Nano
IF：15.8
時間：2020
研究概要：
人血清白蛋白（HSA）具有生物相容性和長循環的特點，被廣泛用作不溶性抗癌藥物的載體，但也存在腫瘤靶向性弱、藥物釋放不可控等缺點。本研究通過基因融合技術，在HSA分離端引入多組氨酸（pHis）、基質金屬蛋白酶-2 （MMP-2）酶切和Arg-Gly-Asp （RGD）肽，以提高HSA的生物學性能。畢赤酵母表達的蛋白可以自組裝成3RGD-HSA-MMP-18His納米顆粒（RHMH18 NPs），并將疏水藥物紫杉醇（PTX）裝載到多組氨酸膠束核心中。RHMH18 NPs由于rgd介導的ανβ3-整合素在腫瘤血管內皮上的特異性結合上調，導致腫瘤部位的治療物質富集，從而表現出高效的腫瘤靶向活性。一旦到達腫瘤微環境，RHMH18 NPs被MMP-2切斷，除去HSA-3RGD部分，留下小而帶正電的組氨酸膠團，可以更有效地穿透腫瘤組織的深部。最后，組氨酸膠團成功地從溶酶體中逃脫，并根據pH釋放藥物。體內實驗結果表明，三段式推進RHMH18 NPs具有良好的腫瘤抑制活性，副作用最小，為腫瘤治療提供了基于蛋白質的藥物傳遞系統的潛在策略。
為確認融合蛋白，采用Western Blot法測定其具體成分，基于質譜法的蛋白的N端和C端序列由百泰派克公司測定。
圖4
3、項目文章三（蛋白De Novo測序）
標題：New fungal protein from Pleurotus ferulae lanzi induces AMPK-mediated autophagy and G1-phase cell cycle arrest in A549 lung cancer cells
新發現的阿韋蘭側耳真菌蛋白誘導A549肺癌細胞ampk介導的自噬和g1期細胞周期阻滯
期刊：International Journal of Biological Macromolecules
IF：7.7
時間：2023
研究概要：
從藥用菌阿魏藍菇中分離到一種具有抗非小細胞肺癌（NSCLC）活性的新蛋白PFAP。純化方法包括在HiTrap辛基FF柱上進行疏水相互作用層析，在Superdex 75柱上進行凝膠過濾。凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示一條分子量為14.68 kDa的單條帶。通過從頭測序和液相色譜-串聯質譜分析，PFAP被鑒定為由135個氨基酸殘基組成的蛋白質，理論分子量為14.81 kDa?；诖撡|量標簽（TMT）的定量蛋白質組學分析和western blotting顯示，在PFAP治療后，AMP活化的蛋白激酶（AMPK）在NSCLC A549細胞中顯著上調。下游調控因子哺乳動物靶雷帕霉素（mTOR）被抑制，導致自噬激活，P62、LC3 II/I等相關蛋白表達上調。PFAP通過上調P53和P21在細胞周期的G1期阻斷NSCLC A549細胞，隨后下調周期蛋白依賴性激酶的表達。在體內異種移植小鼠模型中，PFAP通過相同的機制抑制腫瘤生長。這些結果表明PFAP是一種具有抗NSCLC特性的多功能蛋白。
為得到新蛋白PFAP的序列，采用基于質譜的De Novo方法測定，此部分檢測由百泰派克提供。
圖5
百泰派克生物科技憑借豐富的蛋白質組學研究經驗和強大的技術平臺，致力于為科研機構、制藥企業和生物技術公司提供高效、精準的蛋白序列分析檢測服務。我們的團隊由經驗豐富的專業技術人員組成，能夠根據不同的研究需求，量身定制最合適的分析策略，確保每一個項目都能夠獲得可靠的數據支持。無論是基礎研究、藥物開發還是臨床診斷，百泰派克都能夠為您提供全面的技術支持與解決方案，助力您的科研成果轉化為實際應用。選擇百泰派克，就是選擇專業、高效與可靠的蛋白序列的分析檢測合作伙伴。
參考文獻：
1、Yan, Y., Xiao, J., Huang, F. et al. Phage defence system CBASS is regulated by a prokaryotic E2 enzyme that imitates the ubiquitin pathway. Nat Microbiol 9, 1566–1578 (2024).
2、Wang M, Zhang L, Cai Y, Yang Y, Qiu L, Shen Y, Jin J, Zhou J, Chen J. Bioengineered Human Serum Albumin Fusion Protein as Target/Enzyme/pH Three-Stage Propulsive Drug Vehicle for Tumor Therapy. ACS Nano. 2020 Dec 22;14(12):17405-17418.
3、Liu MH, Liu F, Ng TB, Liu ZK. New fungal protein from Pleurotus ferulae lanzi induces AMPK-mediated autophagy and G1-phase cell cycle arrest in A549 lung cancer cells. Int J Biol Macromol. 2023 Jul 31;244:125453.
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