自然殺傷細胞(NK)作為先天免疫細胞，具有直接殺死惡性細胞的能力，對比基于T細胞的免疫治療，NK細胞不存在移植物抗宿主病(GVHD)、細胞因子釋放綜合征(CRS)、神經毒性等風險，因此NK細胞被認為是具有巨大潛力的免疫治療工具。目前NK細胞應用于臨床的最大阻礙就是如何高效擴增NK細胞，今天我們通過一篇研究文章解析來了解NK細胞擴增技術的newest進展。
正常外周血中NK細胞僅占淋巴細胞的5%-15%，同時NK細胞的產生會隨年齡增長和新陳代謝減緩而減少。但是NK細胞的一大優勢在于他的來源很廣泛，如外周血單核細胞(PBMCs)、臍帶血(UCB)細胞、誘導多能干細胞(iPSCs)、NK細胞系等均可在體外生成NK細胞。文章以此為切入點將不同來源的NK細胞進行分類，針對每一種不同的細胞來源提出不同的擴增方案，同時詳細的介紹了科學家如何用newest的基因編輯理論和技術去改造NK細胞，及影響其細胞功能的細胞因子，Maximum extent的開發NK細胞的免疫功能。
免疫治療中NK細胞的來源和增強能力的策略。各種類型的細胞，包括PBMC、UCB、iPSCs和NK細胞系，已經被用作產生NK細胞用于免疫治療的來源?；蛐揎椉夹g、分化方案和新的合成試劑已被開發用于改善NK細胞的功能
iPSC或胚胎干細胞(ESC)衍生的NK細胞因其具有同質性、高毒性的NK細胞產物而受到科學界的廣泛關注。PBMC因其易于收集、易于體外擴增、無毒副作用等優點，成為NK細胞的主要來源之一，因此著重介紹。
NK 細胞系或誘導多能干細胞 (iPSC)，分離的 NK 細胞在存在或不存在的情況下利用細胞因子刺激進行擴增的飼養細胞
研究發現使用多細胞因子聯合培養比單一細胞因子培養更能有效地誘導NK細胞增殖，IL-2和IL-18聯用的組合擴增效果最理想。而IL-12、IL-15和IL-18的組合可以預先激活NK細胞，賦予NK細胞記憶表型。想要進一步促進NK細胞增殖的話可以加入OK432，科學家也開始嘗試使用被輻射過的腫瘤細胞系和腫瘤細胞膜顆粒來擴增NK細胞，但是這些方案存在較大的風險，畢竟輻射的效果和強度并不是完全可控的，開發成熟的培養系統是目前發展的主流方向。
IL-12、IL-15 和 IL-18證明可誘導細胞因子記憶
換一個角度，我們也可以從NK細胞的本身著手，得益于飛躍式發展的基因編輯技術，我們可以人為干預基因表達，通過修飾與NK細胞代謝和復制相關的基因，可以延長NK細胞的活躍期。有科研小組利用 CRISPR-CAS9技術刪除了NK細胞的CISH基因；使用逆轉錄病毒細胞轉染NK細胞來表達TERT基因，這樣調整CISH和TERT蛋白的含量可以有效的增強抗腫瘤活性。
從人 iPSC 獲得克隆 CISH-/- iPSC-NK 細胞的示意圖。在 WT iPSC 中進行 CRISPR/Cas9 介導的 CISH KO，在克隆水平鑒定 CISH-/-iPSC?？寺U增后，CISH-/- iPSC 通過造血分化為 CD34+ 造血祖細胞，然后使用先前報道的方法通過 NK 細胞分化為 CISH-/- iPSC-NK 細胞
攻克了NK細胞產量和細胞毒性的難題后，我們需要考慮如何將NK細胞大規模的應用于臨床操作。根據前文的介紹，NK細胞的操作和生產過程需要頻繁補充新鮮培養基、細胞因子和生長因子，以確保NK細胞在最佳環境中生長，這無疑增加了引入外部污染物的風險，同時也要考慮生產成本的問題，開發完全自動化、封閉的NK細胞生產系統是必然之舉。
目前用于大規模生產NK細胞的封閉培養系統有滲透性細胞培養瓶G-Rex (Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN, USA)和波式生物反應器(GE Healthcare Life Sciences, Chicago, USA)。這些培養系統不需要反復更換液體或操作細胞，大大降低了污染的風險。此外，封閉的環境和培養瓶的自動化會產生更多活躍的NK細胞。
智能生產操作系統流程（1）開始細胞加工和儲存，包括開始細胞選擇、分離和冷凍保存；（2） 擴展和功能改進，包括NK細胞培養、基因工程、質量控制系統和包裝；（3） 儲存時，產品被冷凍保存。在制造過程中，質量控制系統涉及自動取樣、測試結果評估和智能調整，生產過程與監控系統相互作用。樣品、測試和過程運行參數的所有信息均由監控系統監控。
NK細胞的豐富來源給了科學家更多的選擇，開發具有針對性的擴增方案可以極大提高NK細胞的增值效率?；蚓庉嬁梢詮母旧辖鉀QNK細胞因為缺乏體內記憶性而作用時間較短的弊端。全自動化封閉生產系統加速了NK細胞大規模投入臨床使用的步伐。
對比熱門的T細胞免疫治療，NK細胞在治療殘余腫瘤和控制復發方面具有不可替代的優勢，我們可以預測基于NK細胞的免疫治療在未來會發揮巨大的臨床作用，為病人們帶去治愈的希望。
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解讀文獻：
[1] Fang, F., Xie, S., Chen, M. et al.Advances in NK cell production. Cell Mol lmmunol 19,460–481 (2022). https://doi.org/10.1038/s41423-021-00808-3.
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