氟化物是一種公認的環境污染物，在全球范圍內廣泛存在，我國長期存在飲水型、燃煤型及飲茶型等不同類型的高氟暴露現象，是遭受氟威脅最嚴重、地區分布最廣泛的國家之一。雖然適量的氟對機體牙齒、骨骼的鈣化、神經興奮的傳導和酶系統的代謝均有促進作用，但大量的研究表明高氟暴露可嚴重危害機體健康，包括誘發氟中毒，氟骨病等，還會對腎臟、肝臟、心血管、免疫系統、中樞神經系統等組織均有不同程度的損害作用。值得注意的是，氟化物引起的腦損傷導致中樞神經系統受損的報道先于牙齒病變，研究發現，氟化物暴露可損害神經中樞并誘導記憶功能障礙，且腦功能損傷及其潛在機制可能因氟化物劑量而異。然而氟化物誘發腦功能障礙的機制仍不明確。
研究成果
2023年5月7日，四川農業大學動物醫學院倪學勤教授團隊在國際環境領域知名期刊《Journal of Hazardous Materials》上發表題為“Prolonged Fluoride Exposure Induces Spatial-memory Deficit and Hippocampal Dysfunction by Inhibiting Small Heat Shock Protein 22 in Mice”的研究論文。該研究揭示了長期高氟飲水可導致小鼠線粒體結構和功能受損，調控線粒體結構和功能的蛋白Hsp22通過介導PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3這兩個關鍵信號通路參與高氟所致空間記憶損傷的重要潛在機制。該成果進一步提示了長期生活于高氟暴露地區人民的潛在健康隱患。
結果
01 長期接觸氟化物導致小鼠空間記憶缺陷及認知功能障礙
首先，研究團隊構建氟暴露小鼠模型：4周齡小鼠給予含25ppm（低劑量組）或50ppm（高劑量組）NaF的含氟飲用水，持續56周至老年期（圖1A）。借助Morris水迷宮試驗（Morris water maze, MWM）探討了慢性氟化物暴露對認知功能的影響，定位航行實驗和空間探索實驗結果顯示，氟暴露組小鼠的逃避潛伏期顯著增加，在有效區域（原平臺所在區域）穿梭停留時間明顯降低，提示了長期接觸氟化物導致小鼠空間記憶缺陷，認知學習能力下降，且損傷程度與氟暴露之間存在劑量依賴關系（圖1）。
圖1 長時間接觸氟化物導致小鼠空間記憶障礙
為研究氟暴露是否會在短期內導致小鼠記憶缺陷，研究者分別給予8周齡和48周齡小鼠含氟（50ppm）飲用水，連續12周（圖2A,B）。MWM結果顯示，短期氟暴露組小鼠穿越原平臺次數及逃避潛伏期和對照組小鼠相比無明顯區別（圖2C,D），神經元功能維持至關重要的功能基因BDNF和CREB蛋白表達水平也無明顯變化（圖2E,F）。這些結果提示了氟化物暴露在短期內不會引起記憶缺陷，引起高氟所致空間記憶損傷取決于長期暴露。
圖2 短期氟化物暴露不會引起小鼠記憶缺陷
02 長期氟暴露誘導小鼠海馬損傷及線粒體結構和功能障礙
接下來，研究團隊探究長時間氟暴露對小鼠海馬的影響，發現氟暴露組小鼠的體重、腦重，以及高劑量氟暴露組（F-High）小鼠的腦體指數均明顯低于對照組小鼠（圖3A），氟暴露引起的病理改變主要在海馬CA3和CA1區，表現為神經元變性顯著增加，F-High組小鼠神經元數量明顯降低（圖3D）。氟暴露組小鼠海馬中BDNF和CREB的mRNA和蛋白水平顯著下降（圖3B,C,E）。這些結果提示了長期接觸氟化物誘導海馬損傷。
圖3 長期氟暴露誘導海馬損傷和記憶相關蛋白下調
隨后，研究團隊進一步探究了氟暴露對海馬神經振蕩和神經元動作電位發放的影響。通過對小鼠海馬CA1神經元進行細胞外記錄，發現氟暴露誘發局部場電位（local field potential, LFP）光譜功率變化，LFP顯著降低，同時theta, alpha, beta和gamma頻段振蕩下降（圖4B）。此外，氟暴露組小鼠的海馬神經元放電明顯降低，誘導LTP的能力受損（圖4C,D）。以上結果均呈劑量依賴性（圖4）。
圖4 長期氟暴露改變了海馬神經元放電
透射電鏡（TEM）觀察發現，氟暴露組小鼠海馬線粒體結構異常，神經元凋亡（圖5A），線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）和ATP含量呈劑量依賴性下降（圖5B,C）。通過對海馬線粒體呼吸鏈復合體分析發現，氟暴露導致線粒體生物發生受到抑制，呼吸鏈復合體I/II/III/V活性明顯降低（圖5D-G）。
圖5 長期氟暴露誘導海馬神經元線粒體功能障礙
03 長期氟暴露抑制Hsp22的表達及其介導的PGC-1α/ TFAM和NF-κβ/STAT3信號通路
基于上述結果，研究團隊進一步探討了介導這些影響的潛在調節因子。借助分子生物學技術發現，長時間氟暴露組小鼠中Hsp22和ATF4的表達顯著降低（圖6A,B）。Hsp22缺失和ATF4高表達抑制了線粒體功能，Hsp22可通過PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3這兩個關鍵信號通路介導線粒體功能。PGC-1α-TFAM信號通路促進線粒體生物發生，NF-κβ-STAT3信號通路提高線粒體呼吸鏈酶的活性。鑒于此，作者研究這兩條信號通路發現，氟暴露導致PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3信號通路被抑制，PGC-1α蛋白水平降低，高劑量氟暴露組TFAM蛋白水平亦顯著降低（圖6C-E）。此外，細胞和線粒體中STAT3的蛋白水平各組間無顯著差異，線粒體中p-S727 STAT3（被Hsp22激活并易位到線粒體的效應蛋白）表達水平呈氟暴露劑量依賴性降低（圖6E,F）。
圖6 長期氟暴露抑制海馬Hsp22的表達及其介導的線粒體調控通路
04 Hsp22通過介導PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3信號通路雙向調控長期氟暴露誘發的空間記憶缺陷
為探究Hsp22是否參與氟暴露誘導的小鼠記憶缺陷，研究者在小鼠海馬區注射pAAV-hSyn-EGFP-P2A-Hspb8–3xFLAG-WPRE病毒，以特異性在海馬神經元中過表達Hsp22（圖7A-C）。MWM結果顯示，過表達Hsp22（F + pAAV-Hsp22）可顯著逆轉由氟化物暴露引起的逃避潛伏期增加和穿越原平臺次數減少的現象（圖7D,E）。這提示了Hsp22過表達改善了長時間氟暴露誘發的空間記憶缺陷。
圖7 海馬神經元過表達Hsp22可改善長期氟暴露引起的記憶缺陷
進一步研究發現，Hsp22過表達改善氟暴露引起的突觸可塑性損傷（圖8A-C），以及逆轉了線粒體生物發生受到抑制的情況，恢復線粒體呼吸鏈復合體I/II/V活性，促進ATP水平升高，改善線粒體功能障礙（圖8D-E）。
圖8 海馬神經元過表達Hsp22通過介導PGC-1α-TFAM和STAT3信號通路逆轉長期氟暴露誘導的線粒體功能障礙
最后，研究者在小鼠海馬區下調Hsp22的表達進一步驗證其在氟化物誘導記憶缺陷中的作用，將pAAV-U6-shRNA(Hspb8)-CMV-EGFP-WPRE注射小鼠海馬以下調Hsp22的表達（圖9A-C）。MWM結果顯示，氟暴露組小鼠海馬下調Hsp22表達（F+Hsp22 shRNA）后，加重了小鼠空間記憶損傷，表現為更明顯延長的逃避潛伏期（圖9D-E）。
圖9 Hsp22缺失加重了長期氟暴露誘發的記憶缺陷
借助分子生物學技術和電生理記錄顯示，Hsp22缺失對正常小鼠線粒體功能沒有影響，但加重了氟暴露誘發的海馬突觸可塑性損傷及線粒體生物發生（圖10）。
綜上，這些數據提示了海馬神經元中Hsp22參與氟暴露誘導的小鼠記憶缺陷機制，其通過介導PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3信號通路雙向調控長期氟暴露誘發的空間記憶缺陷，海馬神經元中高表達Hsp22可通過激活信號通路促進線粒體生物發生和線粒體呼吸復合物活性的增強改善氟化物所致的空間記憶缺陷；而下調Hsp22的表達通過抑制線粒體功能加劇高氟導致的認知能力下降。
圖10 Hsp22缺失加劇了長期氟暴露誘導的線粒體功能障礙
結論
本文借助分子生物學技術、行為學范式、病毒載體介導的基因功能獲得/丟失、電生理記錄等手段揭示了長期氟暴露對小鼠空間記憶的影響及其機制。研究發現，長期低劑量高氟飲水可致小鼠空間記憶障礙，海馬線粒體結構和功能受損，且調控線粒體結構和功能的蛋白Hsp22表達受到抑制。通過AAV介導的活體特異性調控海馬Hsp22表達，證實Hsp22下調介導的PGC-1α/ TFAM-mtDNA信號軸以及NF-κβ/STAT3-線粒體酶活性信號軸的抑制是氟所致空間記憶損傷的重要潛在機制。該成果為長期氟暴露導致的中樞神經系統損傷提供了理論支持，并進一步揭示了長期生活于高氟暴露地區人民的潛在健康隱患。
四川農業大學動物醫學院博士辛金鴿為論文第一作者，倪學勤教授為通訊作者。電子科技大學生命科學與技術學院徐鵬教授為論文共同通訊作者。本研究得到了國家自然科學基金及四川省自然科學基金的支持。
和元生物有幸為研究者提供實驗中使用的全部AAV載體，以實際行動助力神經科學研究！
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0304389423008786
