溶瘤病毒（Oncolytic Virus）是一類基于多效作用模式的獨特抗癌藥物，除了病毒誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞裂解之外，還可以激活體內(nèi)腫瘤免疫反應(yīng)。這些經(jīng)過基因改造的多種溶瘤病毒產(chǎn)品已逐步進(jìn)入臨床試驗階段，個別產(chǎn)品已進(jìn)入到臨床III期。溶瘤病毒療法在為試驗不同的治療方案提供機(jī)會的同時，也給產(chǎn)品的臨床轉(zhuǎn)化帶來了挑戰(zhàn)。本篇文章將分上下兩個篇章，以六種在臨床試驗中使用的溶瘤病毒產(chǎn)品為例，描述了溶瘤病毒產(chǎn)品臨床級別生產(chǎn)的要求和挑戰(zhàn)。鑒于先前FDA對溶瘤病毒藥物T-Vec的審批上市，進(jìn)一步擴(kuò)大溶瘤病毒的制造規(guī)模，優(yōu)化產(chǎn)品特性的策略將會受到人們越來越多的關(guān)注。
2015年，美國FDA對來自Amgen的I型單純皰疹病毒產(chǎn)品Imlygic（T-Vec）進(jìn)行了批準(zhǔn)上市，以用于黑色素瘤的治療，成為第—個被業(yè)界廣泛認(rèn)可的溶瘤病毒藥物，并作為在手術(shù)切除、化療、放療、靶向性小分子和抗體類藥物治療之外一類新的臨床腫瘤學(xué)治療手段。與傳統(tǒng)臨床腫瘤治療方式不同的是，溶瘤病毒采用了其特有的作用機(jī)理進(jìn)行針對腫瘤細(xì)胞的病毒感染、復(fù)制、細(xì)胞裂解和擴(kuò)散傳播。溶瘤病毒藥物在近期的臨床和臨床前研究中表明了多效治療活性，包括：1）溶瘤病毒引導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞裂解在動物模型和臨床患者體內(nèi)中被證實可以觸發(fā)全身性腫瘤免疫反應(yīng)；2）治療性目的基因的插入可以通過多種途徑觸發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡；3）腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞對溶瘤病毒敏感，從而導(dǎo)致并間接摧毀腫瘤細(xì)胞。作為一種多功能的治療方式，溶瘤病毒產(chǎn)品為異質(zhì)性腫瘤的治療，避免耐藥性的發(fā)展，以及多種治療手段的聯(lián)合治療的應(yīng)用提供了希望和機(jī)會。
目前，除了以T-Vec為代表的單純皰疹病毒之外，還有多種病毒產(chǎn)品也進(jìn)入到了臨床試驗階段，并展現(xiàn)出優(yōu)秀的潛力。這些溶瘤病毒在病毒結(jié)構(gòu)、大小、基因組、復(fù)制機(jī)制和宿主相互作用方面均存在差異和多樣性，而這些多樣性也更進(jìn)一步為研究者們提供了對溶瘤病毒進(jìn)行改造的機(jī)會。但是，與此同時，溶瘤病毒的多樣性也為研究人員帶來了臨床轉(zhuǎn)化的挑戰(zhàn)，安全性問題以及GMP級生產(chǎn)需要針對每種病毒產(chǎn)品進(jìn)行討論分析。
Fig 1. 多樣化的溶瘤病毒及其作用機(jī)理
（Ungerechts, G. et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development 3, 16018 (2016)）
基于良好的裂解活性和對其結(jié)構(gòu)與復(fù)制周期的不斷研究，腺病毒被視為一種有吸引力的溶瘤病毒候選者。腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，具有中等基因組大小（~30-40kb），可感染的細(xì)胞范圍廣泛。其基因組在感染的過程中不會整合宿主細(xì)胞的染色體中，且病毒滴度高，較易于純化和制備。目前已有多種溶瘤腺病毒已經(jīng)進(jìn)入到了臨床試驗階段，其中CFDA在2005審批通過了溶瘤腺病毒安珂瑞（H101）上市，用于治療以鼻咽癌為主的頭頸部腫瘤。
與任何的新型腫瘤療法一樣，溶瘤腺病毒從實驗室到臨床試驗階段的轉(zhuǎn)化過程，均受制于有關(guān)具體規(guī)定，并且必須滿足關(guān)于選擇性、藥效、穩(wěn)定性和產(chǎn)品表征的明確標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)特別注意穩(wěn)定的GMP工藝流程，包括主細(xì)胞庫的建立、主毒株庫的建立和建立嚴(yán)格穩(wěn)定的質(zhì)量放行標(biāo)準(zhǔn)。在溶瘤腺病毒的生產(chǎn)中，部分生產(chǎn)者會使用HEK293細(xì)胞，以獲得較高的病毒滴度。但是，這些細(xì)胞具有腺病毒E1基因的插入位點，DNA的重組整合很可能導(dǎo)致E1基因?qū)σ吧偷男揎棻煌嘶亍４送猓硪粋€挑戰(zhàn)是對使用的主細(xì)胞庫和主毒株庫的持續(xù)監(jiān)控，包括對細(xì)胞屬性和污染物的監(jiān)控。
皰疹病毒 （Herpes Virus）
單純皰疹病毒（HSV）是一種有包膜的雙鏈DNA病毒，具有較大基因組（~150kb），適合較大的基因片段插入。HSV結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在其包膜和衣殼之間被稱為被膜（tegument）的區(qū)域，包含有20多種HSV蛋白，對HSV的傳染性起到至關(guān)重要。其包膜表面有12個糖蛋白，衣殼也由7種不同的蛋白質(zhì)組成。因此，HSV復(fù)雜的結(jié)構(gòu)對生產(chǎn)制造提出了很多挑戰(zhàn)。這些大尺寸（155 – 240 nm）的病毒，需要在純化過程中保持結(jié)構(gòu)的完整性，且對最終產(chǎn)品完整特性的衡量與描述也提出了挑戰(zhàn)。152kb大小的基因組具有長區(qū)和短區(qū)的特有區(qū)域，每個區(qū)域都能側(cè)接末端重復(fù)區(qū)域（重復(fù)區(qū)域為某些HSV基因多次存在，如ICP34.5），它們相對彼此存在4個可能的排列方向，而每一種排列方向都意味著一種異構(gòu)體的存在。這些特征都使得對HSV基因組全面測定衡量更加復(fù)雜。
基于減毒疫苗株的溶瘤麻疹病毒處于現(xiàn)階段的臨床試驗研究中，作為一種潛在的癌癥治療方式，誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)的腫瘤排斥反應(yīng)。溶瘤麻疹病毒是優(yōu)先通過在惡性腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)的膜蛋白CD46進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。與使用麻疹病毒作為疫苗所不同的是，麻疹病毒的溶瘤活性取決于高濃度的感染性顆粒的存在，整個生產(chǎn)和純化過程必須在溫柔的GMP和無菌條件下進(jìn)行。現(xiàn)階段的批次制備盡管已經(jīng)符合了臨床要求，但純度有進(jìn)一步的提高空間。
當(dāng)前，業(yè)界正在尋求多種策略來提高麻疹病毒制劑的總產(chǎn)量和純度。使用微載體培養(yǎng)或是切換到懸浮培養(yǎng)有希望提高病毒滴度。另外，開發(fā)與麻疹病毒相容的色譜提純技術(shù)，如離子交換色譜，可作為提高與顆粒無關(guān)的核酸和蛋白質(zhì)雜志的去除率的一個選項，從而提高臨床用溶瘤麻疹病毒的批次產(chǎn)量。
Reference:
2. Sheridan, C (2015). First oncolytic virus edges towards approval in surprise vote.
Nat Biotechnol 33: 569–570.
3. Russell, SJ, Peng, KW and Bell, JC (2012). Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol 30: 658–670.
4. Bell, J and McFadden, G (2014). Viruses for tumor therapy. Cell Host Microbe 15: 260–265.
5. Lichty, BD, Breitbach, CJ, Stojdl, DF and Bell, JC (2014). Going viral with cancerimmunotherapy. Nat Rev Cancer 14: 559–567.
6. Woller, N, Gürlevik, E, Ureche, CI, Schumacher, A and Kühnel, F (2014). Oncolytic virusesas anticancer vaccines. Front Oncol 4: 188.
7. Coffin, RS (2015). From virotherapy to oncolytic immunotherapy: where are we now?
CurrOpinVirol 13: 93–100.
8. Bauzon, M and Hermiston, T (2014). Armed therapeutic viruses - a disruptive therapy onthe horizon of cancer immunotherapy. Front Immunol 5: 74.
9. Larson, C, Oronsky, B, Scicinski, J, Fanger, GR, Stirn, M, Oronsky, A et al. (2015). Going viral:a review of replication-selective oncolytic adenoviruses. Oncotarget 6: 19976–19989.
10. Wisher, M (2002). Biosafety and product release testing issues relevant to replicationcompetentoncolytic viruses. Cancer Gene Ther 9: 1056–1061.
11. Lusky, M (2005). Good manufacturing practice production of adenoviral vectors for
clinical trials. Hum Gene Ther 16: 281–291.
12. Working, PK, Lin, A and Borellini, F (2005). Meeting product development challenges inmanufacturing clinical grade oncolytic adenoviruses. Oncogene 24: 7792–7801.
13. Kovesdi, I and Hedley, SJ (2010). Adenoviral producer cells. Viruses 2: 1681–1703.
14. Nadeau, I and Kamen, A (2003). Production of adenovirus vector for gene therapy.
Biotechnol Adv 20: 475–489.
15. Roizman, B (1979). The structure and isomerization of herpes simplex virus genomes. Cell16: 481–494.
16. Liu, BL, Robinson, M, Han, ZQ, Branston, RH, English, C, Reay, P et al. (2003). ICP34.5
deleted herpes simplex virus with enhanced oncolytic, immune stimulating, and antitumourproperties. Gene Ther 10: 292–303.
17. D?rig, RE, Marcil, A, Chopra, A and Richardson, CD (1993). The human CD46 molecule is areceptor for measles virus (Edmonston strain). Cell 75: 295–305.
18. Anderson, BD, Nakamura, T, Russell, SJ and Peng, KW (2004). High CD46 receptor densitydetermines preferential killing of tumor cells by oncolytic measles virus. Cancer Res 64:4919–4926.
19. Langfield, KK, Walker, HJ, Gregory, LC and Federspiel, MJ (2011). Manufacture of measlesviruses. Methods Mol Biol 737: 345–366.
