使用噴墨打印固定浮游藻類孢子-技術前沿-資訊-生物在線

使用噴墨打印固定浮游藻類孢子

作者：上海睿度光電科技有限公司 2021-06-16T00:00 (訪問量:28595)

 

Hwa-Rim Lee所在課題組通過將藻酸鹽-孢子懸浮液打印到氯化鈣溶液中來產生帶有固定孢子的微粒，證明了噴墨打印具有固定藻類的巨大潛力，并且控制包囊孢子數量及其微環境的能力可以促進對包囊孢子微觀相互作用的研究。

 

藻類細胞固定化是廢水處理、有用代謝物生產和養殖管理的常用技術。然而，目前技術中對固定液滴的大小、微生物種群和生產率的控制需要改進。在這里，Hwa-Rim Lee所在課題組首次使用按需噴墨打印將海藻的孢子固定在海藻酸鹽微粒中。通過將藻酸鹽-孢子懸浮液打印到氯化鈣溶液中來產生帶有固定孢子的微粒。他們證明噴墨技術可以通過改變墨水中的孢子密度將噴射液滴中的孢子數量控制在0.23到1.87的范圍內。在基于打印的孢子封裝后，他們觀察到菌體的初始發芽和持續生長，直到培養45天。該研究表明，噴墨打印具有固定藻類的巨大潛力，并且控制封裝孢子數量及其微環境的能力可以促進對封裝孢子微觀相互作用的研究。
將藻類細胞固定在聚合物水凝膠中具有廣泛的應用。固定化藻細胞可用于污水處理，以去除養分、金屬和工業污染物。捕獲的藻類細胞還可用于產生代謝物、測量毒性、通過冷凍保存細胞以及管理原種培養物。該技術還能夠改善固定化藻細胞的代謝、功能和生長。在水凝膠顆粒中捕獲微生物的方法包括將細胞懸浮液常規滴入裝有硬化溶液的容器中；擠壓滴水；重力驅動滴水；懸浮噴涂。所有這些方法要么速度慢，要么無法充分控制液滴的大小、微生物含量或生產率。一種實用的方法將克服這些缺點。
按需噴墨（DOD）噴墨打印廣泛用于各種領域，如生物打印、印刷電子和3D制造。DOD壓電噴墨打印在壓電噴墨打印機的噴嘴通道中使用了一個壓電致動器。電壓脈沖會減少裝有墨水的腔室的體積，因此有些會以液滴的形式噴出。壓電噴墨打印可以在>10kHz下產生大小為1–100pL的液滴。噴射液滴的大小可以通過調整輸入電壓脈沖或選擇合適的噴嘴來控制，并且小于水凝膠中營養物質和代謝物的擴散極限（100-200μm）。小尺寸的微粒可以使捕獲的藻類細胞生長過程中的抑制作用最小化。由于能夠噴射少量墨水，噴墨打印已被用于封裝大分子、藥物和哺乳動物細胞。
 

▲ 圖1   鈣離子與藻酸鹽水凝膠交聯的“雞蛋盒”結構示意圖
海藻酸鹽是海藻和細菌生物膜中的主要多糖之一，是β-D-甘露糖醛酸（M嵌段）和α-L-古洛糖醛酸（G嵌段）的共聚物。藻酸鹽可以在鈣(Ca2+)或鎂(Mg2+)離子存在下形成水凝膠。特別是藻酸鹽中的G嵌段有助于形成強且可逆的交聯網絡，即所謂的“蛋盒結構”（圖1）。由于獨特的蛋盒結構，海藻酸鹽已被用于化妝品、食品、生物醫學/制藥目的和鋰離子電池中的各種涂層應用。由于海藻酸鹽主要是從包括E.cava在內的微藻中分離出來的，因此選擇海藻酸鹽作為聚合物用噴墨打印技術固定E.cava孢子。本研究的目的是證明海藻酸鹽噴墨印打印技術在固定腔孢藻孢子方面的能力。課題組測量了藻酸鹽-孢子懸浮液的粘度并評估了液滴噴射和噴射特性的長期穩定性，以評估懸浮液的噴墨打印性。然后，他們監測液滴中的孢子數量以量化遞送的可控性。最后對固定化孢子在PESI/GeO2培養基中的生長進行量化，以揭示藻類孢子固定化技術的兼容性。
 

材料與方法

海藻酸鈉-孢子懸浮液制劑。海藻酸鈉購自美國MP Biomedical LLC。從韓國濟州島海岸收集E.cava的生殖菌體，然后用冰盒運往實驗室。用自來水清洗泰菌體以去除鹽、沙子和微生物。收集包括孢子囊在內的菌體中間部分，并將碎片置于無菌海水中以釋放孢子。使用脫脂棉過濾孢子懸浮液。來自褐藻（SigmaAldrich，美國）的2%(w/v)海藻酸鈉溶液在120°C下高壓滅菌20分鐘，在室溫下冷卻并使用0.45µm注射器過濾器過濾。將溶液與孢子懸浮液混合以制備最終的0.5%(w/v)海藻酸鈉溶液，濃度為0.125×106、0.500×106或2.00×106個細胞ml-1。
粘度測量。在室溫下使用錐板旋轉粘度計（DV2T，Brookfeld AMETEK，US）測量懸浮液的剪切粘度。粘度計有一個半徑為2.4cm的旋轉錐和一個固定板。將海藻酸鈉-孢子懸浮液（0.5ml）置于板和錐體之間。剪切速率介于50s−1和1,500s−1之間，持續60s；粘度是通過最后10秒（n=3）的平均老化數據得出的。
 
海藻酸鈉-孢子懸浮液的噴墨打印。使用DOD噴墨打印系統（Jetlab II，MicroFab Technologies，Inc.，USA）打印海藻酸鈉-孢子懸浮液。使用直徑為80µm的壓電噴墨噴嘴，并在雙極模式下以±80V施加電壓脈沖。波脈沖的上升時間為6.0µs，停留時間為13µs，下降時間為9.0µs，回波時間為22µs。打印系統中配備的頻閃CCD相機和短時LED燈每30微秒獲取一次噴射形成的圖像。在載玻片上生成打印的海藻酸鈉孢子懸浮液陣列。陣列的液滴間距為400μm，載物臺速度為50mms−1。在光學顯微鏡下觀察打印的陣列并計算每滴孢子的平均數（n=30）。
 
孢子固定化藻酸鹽微粒的制備和培養。使用噴墨打印系統打印海藻酸鈉-孢子懸浮液，將打印的液滴收集在35毫米培養皿中，該培養皿中含有1%（w/v）溶解在海水中的CaCl2。海水已在120°C下高壓滅菌20分鐘，在室溫下冷卻并通過0.45µm過濾器。打印以1,000Hz的噴射頻率進行30分鐘。使用1厘米長的磁力攪拌棒攪拌溶液以防止水凝膠顆粒聚集。打印后，將70μl產生的微粒懸浮液與200μl補充有GeO2的PESI培養基混合，并輸送到96孔板的每個孔中。樣品在15°C、30μmolm-2s-1的光強度和10小時光照：14小時黑暗的日光周期下孵育。在培養的第3、8、14和21天，在顯微鏡下測量E.cava配子體的總長。根據所使用的海藻酸鈉溶液濃度為0.125×106、0.500×106或2.00×106個細胞ml-1不同，E.cava的配子植體的測量數量不同。(n0.125=7,n0.500=15,n2.00=20)
 

▲ 圖2 基于壓電噴墨打印技術生成孢子固定微粒的系統示意圖

所有定量數據均表示為平均值±標準偏差。使用Origin 2016（美國馬薩諸塞州Origin實驗室）進行單向方差分析（ANOVA）和Bonferroni后分析。p值<0.05被認為具有統計學意義。
 

結果與討論

孢子固定化藻酸鹽微粒的制備策略。圖2說明了用于生成含有孢子的海藻酸鹽微粒的餅狀壓電按需噴墨打印系統。當向噴墨噴嘴的壓電致動器施加電壓脈沖時，噴嘴會噴射出一系列海藻酸鈉-孢子懸浮液的皮升液滴，這些液滴沉入容器中的CaCl2溶液中。一旦液滴撞擊溶液表面，Ca2+就會進入海藻酸鹽分子的古洛糖酸鹽塊，從而與相鄰的古洛糖酸鹽塊形成連接。結果，基于藻酸鹽的液滴被交聯并轉化為包裹孢子的水凝膠微粒。將容器中的溶液磁力攪拌以防止水凝膠顆粒聚集（補充圖1）。
海藻酸鈉-孢子懸浮液的粘度和射流形成。在5×101和103s-1之間的剪切速率范圍內測量海藻酸鈉-孢子懸浮液的粘度，以檢查其可打印性。所有懸浮液的粘度都<20mPa?s，這對于穩定打印來說是適當的低（圖3a）。由于孢子非常?。◣孜⒚祝┖偷头秶逆咦用芏龋?.125×106ml-1到2.00×106ml-1），孢子密度對粘度沒有顯著影響。然后，課題組觀察了它們的噴射行為2小時。在實驗過程中沒有觀察到噴嘴堵塞。他們的射流形成的代表性高速圖像如圖3b所示。在相同的驅動波形和可忽略不計的剪切粘度差異下，觀察到液滴速度隨著孢子密度的增加而降低。他們推測懸浮液內的E.cava孢子自然分泌的成分可能會略微增加墨水的彈性。
 
▲ 圖3 (a)不同E.cava孢子密度的海藻酸鈉-孢子懸浮液的粘度
(b)由相同輸入電壓驅動的射流形成圖像（插圖）

 

每滴平均孢子數。為了量化孢子傳遞的可控性，課題組通過將海藻酸鈉-孢子懸浮液的點陣打印到玻璃基板上而不交聯來研究液滴中的孢子數量。然后，使用顯微鏡計算液滴中的孢子數（圖4a，b）。點陣檢查顯示，隨著孢子密度的增加，每滴孢子的平均數量增加：0.125×106ml-1時為0.23，0.500×106ml-1時為0.67，2.00×106ml-1時為1.87（圖3）。4f），隨著孢子密度的增加，點的大小減?。▓D4c-e）。然而，每滴的平均孢子數沒有像懸浮液的孢子密度那樣增加。孢子種群可能增加了懸浮液的粘度和彈性，并減少了噴嘴的墨水噴射量，這在之前的研究中也觀察到?？刂品庋b孢子數量及其微環境的能力表明，壓電噴墨打印技術可能用作研究封裝孢子微觀相互作用的方法。 
 
▲ 圖4 打印點陣圖案以計算每個液滴的平均孢子數。點陣的顯微鏡圖像，放大倍數為20x(a)和40x(b)。具有0.125×106個細胞ml-1(c)、0.500×106個細胞ml-1(d)和2.00×106個細胞ml-1(e)的海藻酸鈉-孢子懸浮液點的代表性圖像。玻璃基板上噴射液滴的尺寸約為200μm(c)、150μm(d)和130μm(e)。白色箭頭表示孢子。(f)與孢子密度相關的每個液滴的實驗和計算平均孢子數（*p<10-4，**p<10-5與在2.00×106個細胞ml-1處獲得的值相比）。
 
固定在藻酸鹽微粒中的E.cava孢子的產生和培養。微粒是使用噴墨打印系統產生的，容器中裝有CaCl2交聯溶液，如圖2所示。為了監測載有孢子的微粒的形態，使用顯微鏡觀察它們。E.cava的孢子固定在藻酸鹽微粒內（圖5，白色箭頭）。藻酸鹽與鈣離子的交聯從打印液滴的邊界快速進行，在此過程中不考慮孢子的損失，并且預期的包囊孢子數量與圖4中的相同。固定在內部的孢子數量微粒隨著懸浮液的孢子密度增加而增加。由于磁力攪拌器的劇烈攪拌，形成的微粒形狀為橢圓形。 
 

▲ 圖5 不同孢子密度的孢子固定微粒顯微圖像
 

▲ 圖6 (a)固定在具有不同孢子密度的藻酸鹽微粒中的E.cava配子體的代表性圖像
(b)固定在藻酸鹽微粒中的E.cava配子體的距骨長度
對捕獲的孢子的突出和生長進行了45天的監測，以證明藻類孢子固定技術的兼容性。固定在微粒中的孢子保持休眠狀態直到第8天（圖6），然后葉狀體開始生長。第14天的平均菌體長度達到~10µm，第21天達到~30µm。培養45天后，E.cava顯示出灌木狀形態。由于孢子是從孢子體中收集的，因此生長中的E.cava顯示出配子體表型。結果表明，噴墨打印可用于固定藻類細胞。此外，生長趨勢不受孢子密度的顯著影響。結果表明，水凝膠微粒內低至中等密度的E.cava孢子不會顯著影響彼此的葉綠體形態。發生這種影響的孢子密度范圍應在未來的研究中確定。
 

結論

在這項研究中，壓電噴墨打印技術用于將E.cava孢子固定在海藻酸鈉懸浮液中。粘度和液滴形成行為表明它們是適合噴墨打印的材料。孢子的空間密度可能會影響海藻酸鈉-孢子懸浮液的粘度和彈性，從而影響噴射形成和低于預期的平均每液滴孢子數。打印技術允許制造孢子固定的藻酸鹽微粒。微粒的培養產生了健康的E.cava配子體，而對孢子密度沒有顯著依賴性。這些結果表明，噴墨打印可用于固定藻類細胞和單細胞封裝。

參考文獻：

[1] Lee H R ,   Sang M J ,   Yoon S , et al. Immobilization of planktonic algal spores by inkjet printing[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1):1-7.

 

上海睿度光電科技有限公司 商家主頁

地 址： 上海市楊浦區翔殷路128號上海理工大學國家大學科技園1號樓B座327

聯系人： 周一

電 話： 021-51816409

傳 真：

Email：service@rd-mv.com

相關咨詢

浙大楊華勇院士團隊生物軟材料的順序交聯式液滴對撞噴墨3D打印工藝 (2025-05-27T00:00 瀏覽數:36255)

MicroFab Inkjet噴墨打印技術助力無損抗炎新突破 (2025-05-02T00:00 瀏覽數:38495)

噴墨打印技術制備藥物-聚合物復合顆粒用于浮動給藥系統 (2025-04-11T00:00 瀏覽數:37701)

噴墨打印技術打造新一代柔性腦機接口實現高精度神經信號采集 (2025-03-28T00:00 瀏覽數:35241)

MicroFab 高精度雙噴頭反應性噴墨（RIJ）3D打印高活性有機硅 (2024-11-08T00:00 瀏覽數:35617)

通過墨水循環改善生物噴墨打印中的細胞分布均勻性 (2025-01-16T00:00 瀏覽數:41725)

MicroFab Inkjet噴墨打印制備人體皮膚等效物在體外免疫診斷的應用 (2024-09-06T00:00 瀏覽數:49204)

一種用于佩戴式精確血糖監測的熱激活差動自校準柔性表皮生物微流體裝置 (2021-02-25T00:00 瀏覽數:42287)

噴墨打印技術在生物傳感器上的應用 (2021-03-02T00:00 瀏覽數:42333)

噴墨打印技術在疾病診斷上的應用 (2021-04-21T00:00 瀏覽數:39451)

ADVERTISEMENT