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那么，能夠高效、安全遞送基因的rAAV是如何被生產出來呢？當下主流的生產系統有兩種，一是利用經典的三質粒包裝系統，瞬時轉染人293細胞產生病毒；另一種即利用攜帶rAAV載體基因組、Rep蛋白和Cap蛋白的桿狀病毒感染Spodoptera frugiperda（Sf9）昆蟲細胞，從而產生rAAV病毒。這兩種生產系統有何差異？實驗和臨床應用時，哪種效果更好？
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基于293細胞的rAAV包裝系統
圖1 三質粒轉染293細胞生產rAAV
圖片來源：Mueller C et al., Curr Protoc Microbiol. 2012
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Sf9包裝系統
Baculovirus/Sf9是一種替代哺乳動物細胞系的rAAV生產方案，該系統利用桿狀病毒表達載體（Baculovirus expression vectors, BEVs）感染Sf9昆蟲細胞來生產rAAV病毒顆粒。借助Sf9細胞可以大量表達重組蛋白的特點，該系統使用含有rAAV基因組以及AAV-Rep、AAV-Cap基因的昆蟲桿狀病毒轉導Sf9細胞，使rAAV在Sf9細胞中組裝，最終達到大規模生產rAAV的目的。
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由于Sf9昆蟲細胞可以在大規模反應器中高密度懸浮培養，因此該系統更容易放大規模；同時，桿狀病毒對于哺乳動物和植物是非致病性的，且采用無血清培養體系，相較依賴質粒轉染的293細胞生產系統更為安全。2012年，歐洲藥品管理局（EMA）批準的首個rAAV基因治療藥物Glybera正是利用Sf9昆蟲細胞生產系統生產的rAAV病毒顆粒。
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293細胞包裝系統與Sf9包裝系統的差異
盡管在過去的10年里，監管部門陸續批準若干基于AAV的基因治療產品，但該領域仍面臨多項挑戰，例如rAAV的產量、質量、免疫原性等。2020年9月，Neil G. Rumachik等人在Mol Ther Methods Clin Dev.發表的工作就對293細胞與Sf9細胞的rAAV生產系統差異做了分析。該工作發現，差異主要集中在生產過程中產生的雜質、衣殼蛋白翻譯后修飾(post-translational modifications, PTMs)和體內/體外的感染效率（圖2）
圖2 Sf9細胞包裝系統與293細胞包裝系統生產的rAAV差異
圖片來源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020
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文中明確指出：
1）不同的包裝系統生產的rAAV病毒顆粒衣殼具有不同的PTMs，包括糖基化、乙?；⒘姿峄图谆▓D3）；
2）兩個包裝系統包裝過程中，rAAV基因組均發生甲基化，但兩套系統似乎對基因組產生了相反的作用，Sf9細胞生產體系產出的rAAV趨向抑制基因表達，293細胞生產的rAAV出現趨向激活基因表達；
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圖3 293細胞和sf9細胞平臺生產的rAAV衣殼修飾差異
圖片來源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020
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3）不同系統生產的rAAV的空殼率及雜質也有所差異，293細胞生產的rAAV病毒空殼率顯著更低（圖3），產生的雜質與包裝過程產生的核酸和蛋白質相關；而Sf9細胞系統空殼率相對較高，雜質與內肽酶活性和蛋白質水解有關，此外，桿狀病毒系統產生的雜質要么是結構性的，要么是與病毒逃逸有關。
4）另外，293細胞生產的rAAV顯現出更強的體內及體外感染能力，研究發現無論是在體內還是體外實驗，無論是通過肌肉注射還是通過尾靜脈系統給藥注射，293細胞生產的rAAV都具有更好的感染能力（圖4）。
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圖4 不同生產體系生產的rAAV在體外及骨骼肌中的感染能力差異
圖片來源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020
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因此，從這些數據展示可以看到，基于293細胞生產的rAAV可能比Sf9有更好的感染效率、更高的質量，也更有臨床應用的潛力。當然，不可否認的是，Sf9系統rAAV包裝體系具有更高的rAAV包裝產率，假以時日，解決上述問題的Sf9包裝系統亦有潛力成為基因治療載體生產的重要力量。
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參考文獻