1．實驗必備（以下器材/試劑必須全部準備齊全才可以開始操作）

2．試劑配制

2.1 實驗前取PEG1450 1ml于無菌EP管37℃預溫；

2.2 HAT完全培養基：20%胎牛血清+1%雙抗(鏈霉素和青霉素)+1/50體積的HAT（50×）+1640不完全培養基，按每塊96孔板20ml配制，于37℃預溫；

2.3 分取50ml 1640不完全培養基37℃預溫（融合后稀釋PEG用）。

3．實驗前準備工作：

實驗前將實驗要用到的離心管、離心管架、剪子、鑷子、勻漿器、細胞篩網、培養皿、固定板等放入超凈臺，紫外照射30min左右。

4．飼養細胞/融合細胞準備

4.1 飼養細胞的制備（可在融合前一天完成，亦可當天制備）：

4.1.1 取空白Balb/c小鼠，眼球取血處死，將其浸入75%乙醇中5min，并且用鑷子將其夾住在乙醇中不時攪動使其充分消毒。

4.1.2 將滅過菌的濾紙鋪在固定板上（內面朝上），用鑷子將老鼠從75%酒精中取出，瀝干酒精。

4.1.3 取無菌固定針頭將老鼠側臥固定（身體左側向上）在固定板上。

4.1.4 用滅菌鑷子輕輕拉起老鼠的腹部皮膚，用滅菌剪刀從下往上剪開一道口子，沿口子將老鼠的皮膚撕開，將其固定（注意：老鼠外側皮毛不要接觸內部）。

4.1.5 取10ml 1640不完全培養基在干凈的滅菌玻璃培養皿里， 10ml注射器吸取5ml培養基，用一個滅菌鑷子輕輕提起老鼠的腹膜，將5ml培養基打入老鼠腹部，同時輕輕按摩老鼠的腹部1min后，將培養基回收，置于50ml無菌離心管中，再次吸取5ml培養基，可重復此步驟多次（此步為取腹腔細胞步驟，如不需則省略）。

4.1.6 取3～5ml 1640不完全培養基放入勻漿器中，用剪刀和鑷子，將鼠腹腔剖開，取出其左側的脾臟剪去表面脂肪，放進勻漿器中輕輕研磨。

4.1.7將研磨的液體通過細胞篩網過濾掉塊狀物。

4.1.8取3～5ml培養基沖洗勻漿器，再次過篩網。

4.1.9將細胞篩網過濾的液體吸入干凈的50ml無菌離心管中，若取了腹腔細胞可合并置于50ml無菌離心管中，加1640不完全培養基至30ml，離心1,500rpm，5min，棄上清。

4.1.10將沉淀重懸于HAT完全培養基，此時飼養細胞已制備好，可按105/孔使用，于融合前一天鋪板105個/100μl/孔，亦可當天隨融合細胞混合鋪板。

4.2 免疫脾細胞制備：

4.2.1 取免疫Balb/c小鼠，眼球取血處死，將其浸入75%乙醇中5min，并且用鑷子將其夾住在75%乙醇中不時攪動使其充分消毒；

4.2.2將滅過菌的濾紙鋪在固定板上（內面朝上），用將老鼠從75%酒精中取出，瀝干酒精。

4.2.3 取無菌固定針頭將老鼠側臥固定（身體左側向上）在固定板上。

4.2.4 用滅菌鑷子輕輕拉起老鼠的腹部皮膚，用滅菌剪刀從下往上剪開一道口子，沿口子將老鼠的皮膚撕開，將其固定（注意：老鼠外側皮毛不要接觸內部）。

4.2.5 取3～5ml 1640不完全培養基放入勻漿器中，用剪刀和鑷子，將鼠腹腔剖開，取出其左側的脾臟剪去表面脂肪，放進勻漿器中輕輕研磨。

4.2.6 將研磨的液體通過細胞篩網過濾掉塊狀物。

4.2.7 取3～5ml 1640不完全培養基沖洗勻漿器，再次過篩網。

4.2.8將細胞篩網過濾的液體吸入干凈的50ml無菌離心管中，置于50ml無菌離心管中，加1640不完全培養基至30ml，離心1,500rpm，5min，棄上清，1640不完全培養基重懸細胞沉淀，備用。

4.3 SP2/0細胞制備：

若SP2/0為培養細胞，直接吹打懸浮起來后離心即可計數使用；若為實體瘤SP2/0，按以下步驟操作：

4.3.1 取背部花生米大小實體瘤的Balb/c小鼠，眼球取血處死，將其浸入75%乙醇中5min，并且用鑷子將其夾住在乙醇中攪動使其充分消毒。

4.3.2 將滅過菌的濾紙鋪在固定板上（內面朝上），用鑷子將老鼠從75%酒精中取出，瀝干酒精。

4.3.3 取無菌固定針頭將老鼠俯臥固定（身體背側向上）在固定板上。

4.3.4 用滅菌鑷子輕輕拉起老鼠的背部近尾側皮膚，用滅菌剪刀從下往上剪開一道口子，沿口子將老鼠的皮膚撕開，將其固定（注意：老鼠外側皮毛不要接觸內部）。

4.3.5 用鑷子和剪刀剪下實體瘤（實體瘤以均勻棕白色，質地松軟不液化為宜，液化部分多為死細胞）放入勻漿器中加入3～5ml1640不完全培養基研磨。

4.3.6 將研磨的液體通過細胞篩網過濾掉塊狀物。

4.3.7 取3～5ml 1640不完全培養基沖洗勻漿器，再次過篩網。

4.3.8 將經過細胞篩網過濾的液體吸入干凈的50ml無菌離心管中，加培養基至30ml離心1,500rpm，5min，棄上清，1640不完全培養基重懸細胞沉淀，備用。

（以上4.1 、4.2 、4.3 三個步驟可以同時進行，融合時細胞離體時間越短其融合效果越好。）

5．融合操作步驟

5.1 用1640不完全培養基將SP2/0細胞和免疫鼠脾細胞重懸，分別用血球計數板計數，按脾細胞：SP2/0細胞=1:3比例于50ml無菌離心管中混合，充分混合后加1640不完全培養基至40ml；

5.2 離心1,500rpm 5min 。

（此時準備37℃的溫水用于細胞融合離心管的溫育。）

5.3 離心后棄上清以及管壁液體（可用滅菌吸水紙條吸干），輕輕敲打SP2/0細胞和免疫鼠細胞混合沉淀使其松動，將離心管底部浸入37℃溫水中。

5.4 從培養箱中取出已溫育的1ml融合劑PEG1450，60s內均勻滴入細胞混合沉淀中（邊滴加邊轉動離心管）。

5.5 靜置溫育45s，取出37℃溫箱中預熱的1640不完全培養基，取1ml，60s均勻滴入沉淀中稀釋PEG融合劑（邊滴加邊轉動離心管），再取1ml，30s內均勻滴入，之后將剩余的45ml培養基全部慢慢滴入。

（注意：不要用力沖擊！此步驟為稀釋融合劑。）

5.6 輕輕顛倒混勻后，離心1,500rpm 5min，棄上清。

5.7 用含有飼養細胞和HAT完全培養基溶液200ml重懸細胞沉淀；若飼養細胞已提前鋪板，則只需用100ml的HAT完全培養基溶液重懸。

（飼養細胞是一把雙刃劍,可以輔助融合雜交瘤細胞生長,但是對于入門新手來說,如果操作不當除了增加污染的風險外,還可能由于使用量太少達不到輔助作用,或者使用量太大,與融合細胞爭奪營養,對融合造成毀滅性破壞。）

福因德生物通過研究雜交瘤細胞生長的規律,發現對雜交瘤細胞生長促進作用最為顯著的是IL-6,EGF等，通過調配這些生長因子的比例和濃度，研發出雜交瘤細胞培養添加劑，使雜交瘤細胞處于最優生長環境，單抗初學者可以選擇此產品，使用此產品后無需再添加飼養細胞，細胞融合后長出的細胞集落均勻，細胞孔背景干凈。