發(fā)表期刊：Advanced Materials
IF：27.4
一作單位：哈爾濱工程大學(xué)
研究背景
銅死亡（cuproptosis）是一種可能觸發(fā)免疫治療的新型細(xì)胞死亡形式，其機(jī)制是過(guò)量銅離子直接結(jié)合線粒體三羧酸循環(huán)中的硫辛酰化組分，導(dǎo)致二氫硫辛酸-乙酰轉(zhuǎn)移酶（DLAT）聚集，最終因相關(guān)毒性作用引發(fā)細(xì)胞死亡。但現(xiàn)有的銅基納米材料無(wú)法有效誘導(dǎo)銅離子聚集，銅離子易被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，致使銅死亡效率低下。因此，亟需一種能夠誘導(dǎo)銅死亡的材料，以逆轉(zhuǎn)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境并清除腫瘤細(xì)胞。
基于銅的半導(dǎo)體鐵電材料有望通過(guò)鐵電效應(yīng)被細(xì)胞吞噬，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。通過(guò)工程化金屬空位，可以調(diào)控p型半導(dǎo)體的催化響應(yīng)，增強(qiáng)表面電荷傳輸。本研究制備了具有豐富銅空位（VCU）且具有優(yōu)異壓電和鐵電特性的納米材料BCO-VCU，能通過(guò)控制蛋白打開(kāi)細(xì)胞膜并關(guān)閉Cu+外流通道，從而加劇銅死亡并觸發(fā)后續(xù)的免疫反應(yīng)。VCU的引入改善了壓電特性和鐵電剩余極化，相應(yīng)優(yōu)化的BCO-VCU也表現(xiàn)出高鐵電催化性能和初始極化強(qiáng)度。由此產(chǎn)生的強(qiáng)內(nèi)置電場(chǎng)為載流子遷移提供了驅(qū)動(dòng)力，高效催化生成活性氧（ROS）誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。密度泛函理論（DFT）計(jì)算揭示了Bi2CuO4（BCO）的半導(dǎo)體類型，VCU是最易形成的空位，這些空位能抑制電子-空穴復(fù)合并提高催化效率。這種鐵電效應(yīng)增加了細(xì)胞膜通透性，增強(qiáng)Cu²+釋放，改變了鐵氧還蛋白1（FDX1）和DLAT的表達(dá)，并增加了三磷酸腺苷（ATP）釋放，這不僅下調(diào)了銅離子泵蛋白的表達(dá)，從而減少Cu²+外排加劇銅死亡，還增加了高遷移率族蛋白B1（HMGB1）的釋放，觸發(fā)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）并刺激后續(xù)免疫反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞（DCs）成熟及巨噬細(xì)胞極化為M1表型，促進(jìn)殺傷性T細(xì)胞分化、免疫微環(huán)境重塑及長(zhǎng)期免疫記憶的建立。
1.形態(tài)學(xué)與結(jié)構(gòu)
BCO-VCU納米顆粒是通過(guò)水熱法制備BCO納米顆粒后，經(jīng)O2退火并接枝聚乙二醇（PEG）以增強(qiáng)生物相容性而獲得的。BCO-VCU納米顆粒呈現(xiàn)約120nm×40nm的矩形形貌，該尺寸范圍與增強(qiáng)滲透性和滯留效應(yīng)相兼容，對(duì)于BCO-VCU納米顆粒的有效攝取及其向腫瘤的滲透至關(guān)重要。該納米顆粒具有四方晶體結(jié)構(gòu)，表面存在VCU缺陷，表征證實(shí)元素分布均勻，且O2退火顯著提升了Cu²+含量。
2.鐵電材料催化活性的體外評(píng)價(jià)
BCO-VCU帶隙較BCO更窄，且其平帶電位更低，表明VCU的引入調(diào)整了能帶結(jié)構(gòu)。VCU還增強(qiáng)了BCO的壓電性能和鐵電極化強(qiáng)度，有利于電荷的分離和轉(zhuǎn)移，能產(chǎn)生更高的催化活性。在催化過(guò)程中，超聲波（US）的機(jī)械攪拌為電子激發(fā)提供了充足能量，可直接激發(fā)電子從價(jià)帶（VB）到導(dǎo)帶（CB），產(chǎn)生的空穴留在VB內(nèi)部，載流子根據(jù)能帶水平引發(fā)氧化還原反應(yīng)。
谷胱甘肽（GSH）是一種內(nèi)源性抗氧化劑，BCO-VCU+US能有效耗竭GSH并產(chǎn)生氧氣，破壞細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)并緩解腫瘤缺氧微環(huán)境。VCU增加了可用于催化的活性位點(diǎn)數(shù)量，并抑制了電子-空穴復(fù)合，進(jìn)一步提高了催化效果。同時(shí)，其鐵電催化作用可高效生成·OH、·O?−和¹O?等多種ROS，這同樣歸因于VCU促進(jìn)電荷分離，從而促進(jìn)了電子向O?的轉(zhuǎn)移和空穴向H?O的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)了ROS的生成。
3.DFT計(jì)算
VCU是BCO中最易形成的空位缺陷，能引入缺陷能級(jí)使BCO-VCU帶隙變窄，并通過(guò)形成低電子密度區(qū)捕獲空穴，提升電子-空穴的分離效率。同時(shí)，VCU作為活性位點(diǎn)能有效吸附并活化H2O2，降低了·OH生成和O2形成的反應(yīng)能壘，從而加速了ROS生成與氧氣析出過(guò)程。
4.體外釋放Cu²+的能力
BCO-VCU納米顆粒在多種生理介質(zhì)中均表現(xiàn)出良好的分散性與穩(wěn)定性。其銅離子釋放行為具有環(huán)境響應(yīng)性：在中性條件（pH 7.2）下幾乎不釋放，確保了其在體循環(huán)中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；而在弱酸性條件（pH 6.4）下，空位缺陷促進(jìn)了Bi-Cu-O鍵的斷裂，BCO-VCU會(huì)緩慢釋放銅離子，且釋放量高于無(wú)空位的BCO，這為其在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了重要優(yōu)勢(shì)，US處理則通過(guò)能量輸入進(jìn)一步加速了這一釋放過(guò)程。
5.體外凋亡與銅誘導(dǎo)凋亡的評(píng)價(jià)
BCO-VCU表現(xiàn)出了良好的安全性及生物相容性，能被細(xì)胞快速內(nèi)吞。體外實(shí)驗(yàn)表明，BCO-VCU在US激活下，能通過(guò)鐵電催化效應(yīng)有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和銅死亡，并激發(fā)后續(xù)的免疫反應(yīng)。具體來(lái)說(shuō)，在US激活下，其產(chǎn)生的鐵電效應(yīng)一方面通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)Ca²+內(nèi)流引發(fā)鈣超載；另一方面催化產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致線粒體損傷，并通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2等蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，BCO-VCU還能在細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)銅死亡，即通過(guò)釋放Cu²+、消耗GSH、產(chǎn)生O2、引起關(guān)鍵蛋白FDX1/LIAS表達(dá)下調(diào)和DLAT異常寡聚，導(dǎo)致獨(dú)特的線粒體毒性。細(xì)胞凋亡和銅死亡后釋放ATP和促炎介質(zhì)HMGB1，有效誘導(dǎo)ICD，增強(qiáng)DCs活化，激活NF-KB信號(hào)通路并導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M1極化，為激發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答奠定了基礎(chǔ)。
6.體內(nèi)抗腫瘤作用
BCO-VCU憑借其高原子序數(shù)元素鉍（Bi）的存在，在體內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)異的CT成像能力，在靜脈注射后能在腫瘤部位有效富集和長(zhǎng)時(shí)間滯留.同時(shí)，該材料也可作為T1加權(quán)磁共振成像（MR）的對(duì)比劑，在注射8小時(shí)后于腫瘤區(qū)域達(dá)到信號(hào)強(qiáng)度峰值。在治療方面，通過(guò)雙側(cè)荷瘤小鼠模型證實(shí)，BCO-VCU在US激活下不僅能顯著抑制原發(fā)性腫瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤的增殖，還能通過(guò)鐵電效應(yīng)激活系統(tǒng)性抗腫瘤免疫應(yīng)答，包括促進(jìn)DCs成熟、增加CD4+和CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化，并降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）比例，從而重塑腫瘤免疫微環(huán)境。此外，該治療未引起其他主要器官的明顯損傷、炎癥反應(yīng)或血液生化指標(biāo)異常，顯示出良好的生物安全性。
7.治療分子機(jī)制
經(jīng)BCO-VCU+US處理的小鼠腫瘤組織與對(duì)照組的RNA轉(zhuǎn)錄分析相比共有775個(gè)差異表達(dá)基因，其中Cxcl3、Cxcl2和Cd4等免疫相關(guān)基因顯著上調(diào)，而參與谷胱甘肽代謝的Gstm1則下調(diào)。這些基因與炎癥反應(yīng)、免疫細(xì)胞分化及氧化應(yīng)激代謝密切相關(guān)。進(jìn)一步的KEGG和GO富集分析表明，經(jīng)BCO-VCU+US處理后大量免疫相關(guān)通路被激活，包括B細(xì)胞受體信號(hào)、cAMP信號(hào)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、Th1/Th2細(xì)胞分化以及趨化因子信號(hào)通路等。這些通路的激活共同促進(jìn)了DCs成熟、M1巨噬細(xì)胞極化和T細(xì)胞分化，并通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH代謝增強(qiáng)氧化應(yīng)激損傷，從而推動(dòng)腫瘤細(xì)胞死亡。
這項(xiàng)研究受鐵電催化啟發(fā)，合理設(shè)計(jì)并工程化了富含VCU的鐵電性BCO-VCU納米顆粒，兼具超高壓電、鐵電性及優(yōu)異的鐵電催化性能。在US激活下，BCO-VCU能有效引發(fā)能帶彎曲和電子-空穴分離并產(chǎn)生高催化活性，導(dǎo)致ROS爆發(fā)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)，其鐵電效應(yīng)增強(qiáng)了細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)了BCO-VCU的內(nèi)吞，進(jìn)而改變了銅死亡關(guān)鍵蛋白FDX1和DLAT的表達(dá)，此過(guò)程還伴隨ATP的釋放，下調(diào)銅離子外排蛋白ATP7A/B的表達(dá)，減少Cu+外流，加劇銅死亡。細(xì)胞凋亡和銅死亡共同激發(fā)了ICD，隨之觸發(fā)了強(qiáng)烈的后續(xù)免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為DCs成熟、巨噬細(xì)胞極化為M1表型、CD8+ T細(xì)胞分化和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）數(shù)量增加，最終實(shí)現(xiàn)了免疫微環(huán)境重塑和免疫記憶，強(qiáng)化了免疫治療效果。
