在重組蛋白表達領域，標簽（tag）的選擇至關重要，尤其是那些能有效提升目標蛋白溶解度和表達量的“小標簽”。其中，NEXT tag 作為一種源自天然 α?型碳酸酐酶（CA）N 端延伸序列的小肽標簽，因其獨特優勢逐漸受到關注。
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起源與發明人
NEXT tag 源自海洋菌 Hydrogenovibrio marinus 的 α?型碳酸酐酶（hmCA）N?端延伸區，由 53 個氨基酸組成（約 5.5?kDa）。Byung?Hoon?Jo 等人在研究中首次將其提煉為一種能顯著提升重組蛋白可溶性與表達量的融合標簽。
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NEXT tag 的氨基酸序列
NEXT tag 的氨基酸序列如下：
AVQHSNAPLIDLGAEMKKQHKEAAPEGAAPAQGKAPAAEAKKEEAPKPKPVV
該序列由 53 個氨基酸組成，分子質量約為 5.5?kDa。研究表明，NEXT tag 是一種“內在無序肽”（IDP），能夠通過熵效應排斥周圍大分子，從而抑制目標蛋白聚集，特別適合解決低表達、易聚集蛋白的問題。
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應用領域
NEXT tag 是一段“內在無序肽”（intrinsically disordered peptide，IDP），能夠通過熵效應排斥周圍大分子，從而抑制目標蛋白聚集，特別適合解決低表達、易聚集蛋白的問題。相比傳統大標簽（如 MBP ~40?kDa、GST ~26?kDa），NEXT tag 更小，對目標蛋白結構和功能影響極小。
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實驗設計
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1.體內溶解度實驗（In vivo solubility） 將 NEXT tag 與多種難溶性蛋白（hEGF、GFP、taCA、isPETase）融合表達。通過 SDS-PAGE 和 Western blot 分析可溶性與不可溶部分的比例。結果顯示 NEXT tag 顯著提高了這些蛋白的可溶性表達比例。 2.與其他標簽對比實驗 將 NEXT tag 與常用標簽（MBP、GST、Fh8）進行比較。在高溫（37°C）和低溫（25°C）條件下表達 GFP 等蛋白，評估可溶性和表達量。NEXT tag 在多數情況下表現最佳，尤其是在高溫下仍能維持高溶解度。 3.體外溶解度實驗（In vitro solubility） 純化帶有不同標簽的 taCA 和 isPETase，改變緩沖液條件（鹽濃度、pH）。通過離心和 SDS-PAGE 分析沉淀情況。NEXT tag 能有效防止蛋白在低鹽或無鹽條件下沉淀。 4.蛋白功能與穩定性測試 測試帶有不同標簽的 taCA 的酶活性和熱穩定性。NEXT tag 對酶活性和穩定性影響最小，優于大標簽如 MBP。 5.N端截斷實驗 將 NEXT tag 逐步截斷，分析各區域對溶解度的貢獻。發現 C端區域（NEXT?C???）主要負責體外溶解度，N端區域對體內溶解度更重要。 6.結構特性分析 使用生物信息學工具（IUPred2A、PONDR、DISpro）預測 NEXT tag 為內在無序蛋白（IDP）。通過圓二色譜（CD）證實 NEXT tag 無規則卷曲結構，支持其“熵刷”（entropic bristle）機制。 |
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主要結論
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NEXT tag 是一種 53個氨基酸 的短肽標簽，具有內在無序特性。
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它能顯著提高難表達蛋白的體內和體外溶解度，且對目標蛋白的活性和穩定性影響極小。
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其作用機制類似于“熵刷”，通過空間排斥效應防止蛋白聚集。
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NEXT tag 在小尺寸、無翻譯后修飾位點、不影響蛋白功能方面優于傳統大標簽（如 MBP、GST）。
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應用案例
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在大腸桿菌表達系統中，用于 taCA（Thermovibrio ammonificans CA）的融合表達時，NEXT tag 顯著提高了產量與溶解性，比 NT11 標簽表現更優。
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與 NT11 標簽相比，NEXT?taCA 在 CO? 變水化酶活性方面提升了約 8.4 倍，而 NT11 僅提升約 3.3 倍。
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在長時間熱穩定性測試（70?°C, ≥?35 天）中，NEXT?tag 使 taCA 的半衰期從 8?天提升至約 10.4?天，穩定性提升約 30?%。
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研究還拓展發現與 NEXT tag 類似的其他 α?CA N?端序列（如 Hcr、Hku），也具有顯著提升表達與溶解性的能力。
關鍵參考文獻
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Jo BH. An intrinsically disordered peptide tag that confers an unusual solubility to aggregation-prone proteins. Appl Environ Microbiol. 2022;88(7):e00097-22.
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Hwang IS, Kim JH, Jo BH. Enhanced production of a thermostable carbonic anhydrase in Escherichia coli by using a modified NEXT tag. Molecules. 2021;26(19):5830.
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Jo BH, et al. Enhanced production of a thermostable carbonic anhydrase in Escherichia coli by using a modified NEXT tag. Molecules. 2021;26(19):5830.