聽力喪失是最常見的感官障礙之一，影響著很多人。根據世衛組織公布的《世界聽力報告》，現有超15億人患有不同程度的聽力損失，到2050年，患聽力損失的人數將近25億。據統計，大約50%的先天性聽力損失與遺傳因素有關，目前臨床上的治療方案主要為佩戴助聽器或植入人工耳蝸，但此類方法沒有從根本上治愈聽力損傷。因此，治療聽力損失需要更好的替代療法。隨著基因治療的蓬勃發展，基于病毒載體的基因療法成為治療遺傳性聽力損失的新熱門賽道。
重組腺相關病毒載體（recombinant Adeno-associated virus, rAAV）具有血清型種類多樣、免疫原性低、長期穩定表達基因、宿主范圍廣等優勢，在基因功能研究和基因治療遞送載體中占據主導地位。
上篇文章我們給大家分享了靶向耳科的AAV血清型（【on-target】AAV感染耳組織 | 血清型·啟動子·注射用量 | 一篇就GO了！），這次小編再次給大家分享一個全新的安全載體—AAV-ie-K558R，其可以高效轉導新生小鼠耳蝸毛細胞（Hair Cells, HCs）和支持細胞（Supporting cells, SCs），顯示了在治療由毛細胞死亡或基因突變引起的聽力損失方面的臨床潛力。相關研究成果由上?？萍即髮W鐘桂生、上海交通大學吳皓及東南大學柴人杰合作于2022年4月22日，發表在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志，標題為“AAV-ie-K558R mediated cochlear gene therapy and hair cell regeneration”。
內耳包含三種主要功能細胞：毛細胞（Hair Cells, HCs）、支持細胞（Supporting cells, SCs）和螺旋神經節（Spiral Ganglion Neurons, SGNs），其中HCs又包括內毛細胞（Inner hair cells, IHCs）和外毛細胞（Outer hair cells, OHCs），OHCs負責將聲音放大；IHCs負責將液體波動轉化為電信號，并通過聽覺神經傳遞到聽覺腦干，再到聽覺皮層。
內耳耳蝸HCs和SCs對聽力至關重要，感音神經性聽力損失可能由HCs和SCs的基因突變引起，此外，在非遺傳情況，如噪音、耳毒性藥物或衰老，也可通過損害HCs引起耳聾。在任何一種情況下，這些損害對于沒有再生能力的耳蝸細胞的哺乳動物都是不可逆轉的。目前的研究認為，SCs具有轉分化為HC樣細胞的潛力，因此，HC再生被認為是非遺傳應激引起的獲得性耳聾的潛在治療方法。
該團隊早在2019年全新篩選發現的AAV-ie，可以更高效感染HCs和多種類型SCs。此外，AAV-ie攜帶Atoh1（耳蝸毛細胞再生因子）感染內耳后，實現了內毛細胞再生。但是AAV-ie在耳蝸基底區的轉導效率有待提高。
結果
1 AAV-ie-K558R是一種安全的高效靶向HCs和SCs的載體
首先，該團隊基于之前篩選發現的AAV血清型—AAV-ie（高效轉導嚙齒類和人的HCs和多種類型SCs，但在耳蝸基底區的轉導效率較低）基礎上做進一步篩選，發現AAV-ie-K558R對耳蝸基底OHCs和IHCs具有較高的轉導率。和AAV-ie相比，AAV-ie-K558R對耳蝸中部OHCs的轉錄及耳蝸基底SCs的轉導均有所提高（圖1a-f）。這提示了AAV-ie-K558R可以高效靶向耳蝸和內耳橢圓囊中的不同細胞類型。
圖1 AAV-ie-K558R轉導效率提高
進一步，研究團隊通過電鏡、ABR測試、DPOAE測試及行為學等手段驗證了AAV-ie-K558R的安全性，發現P3小鼠圓窗膜（round window membrane, RWM）注射AAV-ie-K558R后，毛細胞形態無明顯變化，聽覺功能及前庭功能和對照組相比無明顯差異（圖2）。這些結果提示了，AAV-ie-K558R作為一種安全的高效靶向HCs和SCs的載體，在介導聽覺系統疾病的基因療法中的巨大潛力。
圖2 AAV-ie-K558R是一種安全載體
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2 AAV-ie-K558R在糾正功能失調的基因突變或用于 HC 樣再生中的潛力
Prestin（馬達蛋白）是一種特異性定位于外毛細胞的關鍵分子，其能驅動耳蝸外毛細胞的電能動性，產生耳蝸的放大器作用，Prestin蛋白的缺失或基因的突變會導致聽力功能嚴重受損。因此，研究團隊借助Prestin KO小鼠測試AAV-ie-K558R在治療由內耳毛細胞基因功能障礙引發的聽力損傷中的潛力。將AAV-ie-K558R-Prestin通過圓窗膜注射P2 Prestin KO小鼠。結果發現，可以部分恢復 Prestin KO 小鼠的聽力損失（圖3）。
圖3 AAV-ie-K558R-Prestin恢復Prestin KO小鼠的聽覺功能
毛細胞再生可能有助于恢復由衰老、噪音或耳毒性藥物引起的聽力損失。耳蝸毛細胞再生因子Atoh1被證明能夠將SCs轉分化為HCs，基于此，研究者進一步探究AAV-ie-K558R在HC再生中的潛力。借助AAV-ie-K558R攜帶Atoh1注射新生小鼠（P3）耳蝸中，在P14時發現，AAV-ie-K558R-Atoh1組小鼠大上皮嵴（greater epithelial ridge，GER區）觀察到大量的新HCs（表達Myo7a），且一些新HC樣細胞也表達Sox2，提示了這些新再生的細胞可能處于發育的不同階段（圖4a,b）。通過電鏡觀察新再生細胞的形態發現，IHC區域下方的HC樣細胞中生長出毛發束（圖4c）。該團隊早期研究發現AAV-ie-Atoh1也可以誘導HC樣細胞再生，而AAV-ie-K558R-Atoh1可以誘導耳蝸GER區的HC樣細胞再生，且新生成的HC樣細胞形態不同，有些細胞具有動纖毛（代表著耳蝸毛細胞發育較為成熟階段）?？傊?，這些結果提示了AAV-ie-K558R 可以通過傳遞Atoh1強烈誘導耳蝸中的 HC 樣細胞再生。
圖4 AAV-ie-K558R-Atoh1誘導耳蝸中的 HC 樣細胞再生
結論
該團隊通過對AAV衣殼進行突變篩選，在AAV-ie的基礎上篩選出新的AAV-ie-K558R載體，可以高效感染耳蝸HCs和SCs，并且通過攜帶不同基因，恢復了由基因突變導致的聽力損傷，以及誘導HC樣細胞再生。證明了AAV-ie-K558R在治療由毛細胞死亡或基因突變引起的聽力損失方面的臨床潛力。
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