三陰性乳腺癌(TNBC)指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(HER2)三者免疫組織化學染色結果均為陰性的乳腺癌，被稱為“最毒乳腺癌”。傳統的內分泌治療和HER2靶向治療對TNBC患者治療效果不佳，而程序性死亡蛋白1(PD-1)和程序性細胞死亡配體1(PD-L1) 作用的免疫檢查點阻斷療法(ICB)能夠使部分TNBC患者獲益，但目前缺乏可靠的生物標志物來識別應答者。
盡管多細胞組織預處理可能表明ICB是否可以增強免疫應答反應，但ICB如何重塑組織結構以實現這一點仍然模糊不清，在治療期間的組織動態與免疫應答之間的關系尚不清楚。
為了回答這個問題，劍橋大學Raza Ali團隊以及意大利San Raffaele醫院Giampaolo Bianchini課題組在新輔助療法的隨機試驗中，使用組織成像質譜流式（Imaging mass cytometry, IMC）精確量化了患者腫瘤中采樣的三個時間點的細胞的表型、活化狀態和空間位置與TNBC免疫治療的應答。研究論文發表在《Nature》上，題為“Spatial predictors of immunotherapy response in triple-negative breast cancer”，通過繪制TNBC原位多細胞腫瘤生態系統圖，發現了關鍵的ICB 反應預測因子，并表明 ICB 能明顯重塑腫瘤結構。
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作者在三個時間點取樣（基線，n= 243；治療早期，n= 207；治療后，n= 210），采用IMC技術對43種蛋白質進行單細胞蛋白表達和空間分布的分析，獲得共1855張高維組織圖像，用于后續數據分析。這些FFPE樣本來自于NeoTRIP 三期臨床對照試驗，通過1:1隨機比較了新輔助化療（卡鉑和白蛋白結合型紫杉醇）與化療聯合抗PD-L1免疫療法（卡鉑、白蛋白結合型紫杉醇和阿替利珠單抗）。
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圖1a.?NeoTRIP免疫療法試驗的IMC工作流程
圖1b. IMC檢測43種蛋白列表
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精準定義細胞表型：使用深度學習分離上皮細胞（癌細胞）和TME細胞，聚類得到17種上皮表型和20種TME表型。
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【癌癥-免疫相互作用預測ICB的應答效應】
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圖2b.?基線期的免疫療法響應空間預測因子PDL1+IDO+APC；
圖2c 不同治療組對應PDL1+IDO+APC密度
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首先，作者探索了不同上皮和腫瘤微環境細胞表型的密度是否在預測響應方面存在差異，發現只有PDL1+IDO+APC密度可以預測ICB的響應（圖2b-c）。緊接著，研究不同的細胞-細胞相互作用是否與免疫治療的反應相關，結果發現，上皮-CD20+B（Pinteraction?= 0.003，FDR = 0.06）和上皮-CD8+GZMB+T（Pinteraction?= 0.006，FDR = 0.06）細胞交互顯示最大的差異效應。TME細胞則沒有發現差異反應的顯著預測因子。通過對接觸癌細胞的T細胞進行分析，發現其更會增殖的關鍵活化標記物。以上這些發現證實了細胞-細胞相互作用的功能意義。
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【增殖評分預測ICB的應答效應】
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與癌細胞接觸的T細胞更常是Ki67+，也與ICB反應中的增殖有關。作者計算了每個表型中Ki67+細胞的比例（增殖評分），并測試了其與pCR的相關性。
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圖3b. 不同腫瘤增殖評分與免疫治療反應的統計
圖3c. 不同TME細胞類型與免疫治療反應的統計
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結果顯示，當患者接受免疫治療時，共計12種上皮細胞和16種TME細胞表型預測應答（圖3b-c）。MHCI&IIhi細胞的增殖評分是上皮（癌癥）細胞免疫治療反應的最強預測因子，而CD8+ TCF1+ T細胞是整體上最強的免疫治療反應預測因子。然而，MHCI&IIhi癌細胞和CD8+ TCF1+ T細胞的增殖分數僅呈中度相關（ρ = 0.46）。值得注意的是，CD8+ TCF1+ T細胞是一種干細胞樣群體，它是ICB誘導的增殖發生的基礎?？傮w結論是，治療前的增殖評分富集了處于不同激活狀態的細胞，并識別了預測ICB反應的表型。
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【治療后的ICB響應預測因子】
作者還研究了治療早期的細胞密度、細胞-細胞相互作用和免疫治療反應之間的聯系。
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治療早期免疫響應的細胞表型預測：圖4a，上皮細胞表型密度與pCR之間的比值比，圖4b，各治療組CD8+GZMB+T上皮細胞密度和治療反應的關系
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TME細胞密度中只有CD8+GZMB+T細胞顯示顯著差異免疫治療反應預測（Pinteraction?=0.04，FDR=0.5,圖4a-b），為同型細胞相互作用。在一些ICB耐藥的病例中，癌細胞中CD15的表達具有顯著的高表達模式。我們還觀察到CD15+癌細胞灶被CD15+白細胞包圍，這表明異型相互作用可能是狀態轉變的驅動因素。對免疫治療應答的特征是CD8+ GZMB+ T細胞的積累，而異型CD79a+漿細胞相互作用和CD15+癌細胞意味著耐藥腫瘤。
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【ICB免疫應答的細胞動態變化】
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與基線相比，我們發現了治療時免疫治療響應的不同驅動因素，促使作者研究了新輔助免疫治療的細胞動態變化。免疫細胞在治療早期顯著增加，而在治療后顯著減少，同時上皮（癌癥）細胞減少，基質細胞增加（圖5a）。這種模式在所有組中都重復了，但變化的程度不同：在應答者中免疫細胞早期比例的增加更大，而在接受免疫治療的應答者中最大。
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圖5a. 免疫治療的細胞動態變化
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【主要的ICB應答預測因子】
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作者獲得了148個組織特征（37個細胞表型的密度；37個異型和37個同型細胞-細胞相互作用；37個增殖評分），并發現其比化療反應更能預測免疫治療。
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圖6. 預測ICB響應的多變量模型，免疫治療反應的基線(d)和治療中(e)預測因子在模型中的重要性排序
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總的來說，增殖的CF1T+ CD8+ T細胞和MHCII+ 癌細胞的分數是免疫應答的主要預測因子，其次是與B細胞和GZMB+ T細胞的癌癥免疫相互作用。在治療過程中，反應性腫瘤含有豐富的GZMB+ T細胞，而耐藥腫瘤則以CD15+ 癌細胞為特征。通過結合治療前和治療中的組織特征，可以最好地預測應答，指出早期活檢在指導適應性治療中的作用。
該研究表明，多細胞空間組織分布是三陰性乳腺癌ICB療效的主要決定因素，并提示原位系統分析腫瘤微環境細胞分布將有助于實現腫瘤精準免疫治療。
組織成像質譜分析系統采用金屬標簽，幫助客戶順利開展43種蛋白的分析，具有實驗設計簡便、實驗結果可靠的特點，其完整的解決方案為三陰性乳腺癌腫瘤組織與TME組織的原位空間分布提供了全面的視角，幫助用戶實現對不同階段樣本的細胞組成和功能進行挖掘，進而一窺ICB重塑細胞組織結構的過程。
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參考文獻：
Wang, X.Q., Danenberg, E., Huang, C.S., Egle, D., Callari, M., Bermejo, B., Dugo, M., Zamagni, C., Thill, M., Anton, A. and Zambelli, S., 2023. Spatial predictors of immunotherapy response in triple-negative breast cancer.?Nature,?621(7980), pp.868-876.
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