使用CESI-MS技術分離檢測單克隆抗體的蛋白亞型以及抗體的純度-商家動態-資訊-生物在線

使用CESI-MS技術分離檢測單克隆抗體的蛋白亞型以及抗體的純度

作者：北京昊諾斯科技有限公司 2016-08-19T15:32 (訪問量:8211)

使用CESI-MS技術分離檢測單克隆抗體的蛋白亞型以及抗體的純度

?

引言
?
免疫球蛋白（IgGs）是制備治療性單克隆抗體（mAbs）過程中最常見的分子。運用高靈敏度的檢測手段全面研究這些分子的性質，對于抗體藥物的開發、藥效控制、生物利用度以及安全性而言是必不可少的。近幾十年來，對于完整的單克隆抗體以及還原的單克隆抗體的分析已成為生物制藥產業的標準技術，并且這些研究工作逐漸向CESI?平臺延伸。我們利用CESI-MS技術在一次分析過程中，同時獲得完整或者還原的單克隆抗體的電荷異質性、純度以及分子量等信息。分析結果與CE-SDS以及毛細管等點聚焦（cIEF）的分析結果是相吻合。CE-SDS和cIEF是目前工業中認可的兩種分析單克隆抗體藥物的方法。

CE和MS分別是單克隆抗體的電荷異質性、純度以及分子量表征的重要方法。而將CE與MS結合起來，我們就可以將單克隆抗體的電荷異質性、純度以及分子量等幾種表征結合到一次分析中來完成。此外，高分辨的質譜檢測技術可以幫助我們鑒定未知的CE峰。相對于光學檢測，也可以獲得更為準確的純度信息和分子量信息。
?
CESI技術是將CE與電噴霧整合在一個過程當中，同時也降低了質譜分析對樣品的要求。在這部分工作中，我們使用CESI-MS技術同時測定了單克隆抗體的電荷異質性、純度以及分子量等信息。為了實現這一目的，我們使用CESI-MS技術以及其他基于CE的技術對完整的和還原的IgG1，IgG2以及IgG4進行了分析。
?

?

CESI-MS技術分析單克隆抗體的電荷異質性采用的是CZE的模式，結果和采用cIEF方法的結果是一致的1-3。蛋白的翻譯后修飾，例如糖基化修飾引起電荷異質性，這些異構體在電泳中的遷移時間有所不同。電荷異質性分離中的另外一些峰也可能是樣品中存在的雜質。此外，在基于CZE測定單克隆抗體電荷異質性的實驗中使用質譜作為檢測器的優勢在于：可以同時獲得分子量以及樣品的純度的信息。
?
?
CESI 8000 Triple TOF? 6600聯用。使用的離子源型號是Nanospray III，毛細管是中性涂層毛細管。
?
?
實驗材料和方法

樣品制備：在CESI-MS技術的實驗中，IgG1，IgG2以及IgG4的溶液（濃度為20 mg/mL）使用脫鹽柱（Thermo Fisher Scientific）脫鹽，然后溶解在50mM（pH 4）的醋酸銨溶液中。IgG的還原是向IgG的溶液中加入10 mM的 二硫蘇糖醇和0.1%的Rapigest SF表面活性劑（Waters），然后在60 ℃下恒溫45分鐘。加入0.5 %的甲酸，37 ℃恒溫10分鐘，將Rapigest切斷，隨后加入沉淀劑將Rapigest去除。然后向溶液中加入高濃度（2 M，pH 4）的醋酸銨使其終濃度為50 mM。單獨使用CE時，IgG分子被溶解在兩性電解質的溶液中（cIEF）或者SDS的凝膠溶液中（CE-SDS）。在SDS凝膠溶液中的還原反應是在60 ℃下進行的，加入10 mM二硫蘇糖醇，恒溫10分鐘。
?
?
CESI 8000單獨進行毛細管電泳時的條件：CE-SDS和cIEF的實驗使用的SCIEX PA 800 Plus的試劑盒和操作流程。

CESI 8000與質譜聯用時的條件：CESI的實驗使用的儀器是SCIEX CESI 8000 Plus系統。該系統具有控溫的自動進樣系統，最大電壓為30 kV的高壓系統。使用的毛細管是中性涂層毛細管，毛細管的尖端經過腐蝕形成一個電噴霧的噴口。分離過程中的緩沖溶液和導電溶液是3%的醋酸。進樣壓力為5 psi，進樣時間為10 s，進入毛細管的樣品體積約為7.5 nL。由于樣品是溶解在50 mM的醋酸銨中，因此在進樣之后會有一個瞬態的等速電泳過程將樣品進行堆積。預分離過程中，分離條件為：電壓30 kV，壓力2psi，分離時間為7 min。然后將壓力增大到10 psi分離10 min，并進行電噴霧。
?
?
質譜條件：CESI 8000 與Triple TOF?6600聯用，使用的離子源型號是Nanospray III，連接CESI的適配器。完整蛋白的掃描范圍為400-4500 m/z。
?
數據處理：處理高分辨的質譜數據使用的軟件是SCIEX PeakView?和BioPharmaView?
?
?
?

結果與討論
?
CESI-MS技術對單克隆抗體的分析使用的是中性涂層的毛細管，分別測定了非還原以及還原的樣品。非還原的IgG1經過CZE的分離（圖1），獲了它的電荷異質性信息，同時也準確地測定了不同異構體的分子量，此外根據去卷積的結果也鑒定了樣品中的雜質。我們檢測到了兩類主要的的IgG1，含量高的一類IgG1的平均分子量是146900 Da，另外一種酸化的IgG1的平均分子量為151005 Da。除了分子量的不同，它們的糖型也不相同。經過對去卷積的結果進一步處理，能夠促進我們對氨基酸序列和糖型的測定。通過質譜我們檢測到了另外兩種類型的IgG1，它可能是樣品處理過程中產生的雜質。IgG1的雜質里包含了大量的分子量為28608、36687和46585的分子。雜質中最大分子量為100545，與重鏈-重鏈二聚體的分子量和糖型是一致的。
?
?
?
圖1.使用質譜對lgG1的電荷異質性進行檢測。圖為非還原型lgG1
北京昊諾斯科技有限公司 商家主頁

地 址： 北京市朝陽區小營路17號一幢金盟大廈五層5-503室

聯系人： 王女士

電 話： 010-64838766-237

傳 真： 010-64842431/64838766/64838775-249

Email：wangqian@herosbio.com

相關咨詢

Vilber應用|自組裝卟啉納米藥物作為單一治療劑用于癌癥協同治療：一石三鳥之計 (2021-06-25T17:14 瀏覽數:38001)

徠 “玩” 病理 “涂鴉” (2021-06-17T11:28 瀏覽數:32203)

給你點 “顏色” 看看~ (2021-06-10T13:52 瀏覽數:31976)

Vilber 應用文獻 |【JIPB】​中國林科院林業所盧孟柱組發現木材形成調控的新機制 (2021-05-27T11:07 瀏覽數:27357)

CISILE2021成功舉辦，昊諾斯生物收獲頗豐 (2021-05-24T14:35 瀏覽數:24520)

Vilber應用文獻 | ACS Appl. Mater. Interfaces】近紅外激光觸發的腫瘤深處藥物釋放 (2021-04-30T13:30 瀏覽數:23467)

新藥研發的拐點-CM3600 XP (2021-04-23T15:54 瀏覽數:22906)

新冠研究 | 法匹拉韋抑制新冠病毒復制的機制 (2021-03-04T13:39 瀏覽數:26946)

FUSION FX7成像系統入駐2020年諾貝爾化學獎獲得者卡彭蒂耶實驗室 (2021-02-20T13:18 瀏覽數:26038)

CBioPC2020順利召開，RS-200驚艷全場 (2020-12-07T16:01 瀏覽數:26265)

ADVERTISEMENT