??? PCR擴增產物的鑒定
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??? 實驗原理
??? 生物大分子如蛋白質、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中．它們的凈電荷取決于介質的H濃度或與其他大分子的相互作用。在電場中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移．遷移的方向取決于它們帶電的符號．這種遷移現象即謂電泳。遷移的方式目前可以根據分子尺寸大小、分子所帶的電荷或分子的生物學與化學特性分為三類。如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中，使顆粒具有一定遷移速率的驅動力來自于顆粒的有效電荷Q和電位梯度E。它們與介質的摩擦阻力f抗衡：在自由溶液中，這種抗衡服從斯托克斯定律。f=6πrvη這里v是在介質粘度為η半徑為r的顆粒的移動速度。但在凝膠中，這種抗衡并不完全符合斯托克斯定律。f還取決于介質小的其他因子，如凝膠厚度、顆粒尺寸、甚至介質的內滲率等。簡言之電泳就是帶電顆粒在電場中定向移動。
??? 銀染顯色的原理是用甲醛將沉積在DNA帶上的銀離子（**銀）還原成金屬銀而顯帶。
??? 實驗試劑
??? 1.聚丙烯酰胺（C=30%T=5%）：丙烯酰胺28.5g、N，N’-二甲基雙丙烯酰胺1.5g、DDH2O100ml；
??? 2.7％聚丙烯酰胺：30％聚丙烯酰胺23.3ml、10ml10×TBE溶液、66.7mlDDH2O；
??? 3.10×TBE溶液：Tris113g、硼酸55g、1000mlDDH2O；
??? 4.1×TBE溶液：10×TBE溶液100ml，900mlDDH2O；
??? 5.10%乙醇；
??? 6.0.1%**；
??? 7.0.2%AgNO3：
??? 8.AgNO30.15g、DH2O225ml；
??? 9.30%NaCO3-甲醛：NaCO330g、甲醛0.85ml；
??? 10.0.1%AgNO3：AgNO31g、1000mlDH2O；
??? 11.上樣緩沖液：0.25％二甲苯*藍、0.25％溴酚藍；
??? 12.TEMED；
??? 13.10％過硫酸胺：過硫酸胺1g、10mlDDH2O。
??? 實驗設備
??? 1.垂直電泳儀
??? 2.垂直電泳槽
??? 3.玻璃
??? 4.橡膠模框
??? 5.點樣梳
??? 6.搖床
??? 7.微量進樣器
??? 8.染色托盤
??? 實驗材料
??? PCR擴增產物
??? 實驗步驟
??? 1.電泳槽玻璃板的處理：用洗滌劑清洗玻璃板，自來水反復沖凈洗滌劑，雙蒸水沖洗3次，烘干，將兩塊玻璃裝入恰當德橡膠?？騼龋⒔M裝好電泳槽（帶長玻璃的貯液槽為正極，帶短玻璃的貯液槽為陰極）。
??? 2.制膠：加35μlTEMED和300μl2.5％過硫酸胺至7％聚丙烯酰胺溶液中混勻。以60O角，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中，直至灌滿模具頂部。立即插入相應的點樣梳，（小心勿使梳齒下帶進氣泡，并且不要將梳齒全部插入膠內，留約2mm梳齒于玻璃板上端，以免拔梳時把膠孔拔斷）。由于凝膠在聚合過程中有回縮，所以應小心添加些膠液于梳子處，水平放置，室溫聚合1小時。向電泳槽內灌入1×TBE電泳緩沖液。小心取出點樣梳，用槽內的緩沖液反復沖洗點樣孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。
??? 3.加樣：取2-4μl擴增產物和2μl上樣緩沖液混勻,用微量進樣器小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可適當增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。
??? 4.電泳：電泳槽接上電極開啟電源，根據擴增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小，決定電泳的電壓及電泳時間。通常室溫下以l～5V／cm電泳。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時,停止電泳。
??? 5.銀染法顯色：
??? 1)方法一：
??? a.將PAG板浸入10%乙醇溶液固定10min，用純水洗一次；
??? b.0.1%**3min，蒸餾水洗兩次。
??? c.0.2%AgNO3溶液中10min，用去離子水洗三次；
??? d.用30%NaCO3-甲醛溶液顯色至滿意為止，用適量10%冰乙酸終止顯色。
??? 2)方法二：
??? a.取下凝膠，蒸餾水清洗凝膠30秒；
??? b.0.1%**銀染色10分鐘；
??? c.棄去染色液，蒸餾水洗膠兩次；
??? d.顯色液（顯色液配方：10gNaOH0.2gNa2CO32ml甲醛溶液，定溶到500ml）顯色至滿意為止。
??? 6.分型：參照基因階梯的電泳譜帶進行分型。
??? 注意事項
??? 1.每加完一個樣品要清洗微量進樣器,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。
??? 2.以二甲苯*藍和溴酚藍的位置大致判斷泳動距離，7％聚丙烯酰胺非變性膠中溴酚藍相當于170bp的泳動距離，二甲苯*藍相當于40bp的泳動距離。
??? 3.銀染時顯色液配制好在4-10℃預冷可以減輕膠板的底色，銀染后膠板在水中漂洗時間控制在10s以內。