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重組腺相關病毒(RecombinantAdeno-associated Virus, rAAV)是一種可以高效遞送外源基因在體內穩定表達的工具病毒載體，具有免疫原性低、轉導效率高、無自主復制能力等多種特點，且擁有上百種靶向性各異的血清型，可實現特異組織/細胞基因遞送?；诙喾N優點，rAAV被廣泛應用于臨床前基因功能研究和人類重大疾病的基因治療，如視網膜疾病、血友病、神經系統疾病及心血管疾病等。數款rAAV基因治療藥物獲批臨床應用。
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目前rAAV在基礎研究和基因治療領域被大量應用，然而對于rAAV載體在細胞水平上與宿主之間的相互作用理解仍不完全，提高這方面的認識將有助于更精準地以細胞/組織特異性的方式調控基因的表達，提高rAAV轉導效率，增加臨床試驗中rAAV基因治療的成功。
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rAAV感染機制的第一步是先要進入細胞，目前微小病毒進入細胞的方式是從衣殼結合到細胞表面的聚糖或糖復合物開始的，這促進了衣殼與細胞表面的共受體相互作用，實現內化（圖1A）。rAAV不同血清型衣殼的特定結構位點決定了各自聚糖受體和共受體的特異性（表1）。如AAV2，其結合以硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteo-glycan,HSPG)為主要受體，并利用整聯蛋白和生長因子受體作為共受體進入細胞。同時，全基因組篩查發現，跨膜蛋白KIAA0319L是rAAV轉導細胞所必需的宿主因子，可作為幾種常見的rAAV血清型的受體，被命名為通用AAV受體(AAVR)，當衣殼與細胞表面的聚糖結合穩定，rAAV通過KIAA0319L依賴或非依賴的方式進行內化。
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表一 AAV血清型特異性受體，共受體和進入因子
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rAAV與細胞表面特異性受體結合，激活胞內信號通路，進而觸發受體介導的內吞作用。這一過程可以依賴多種方式發生，比如有的依賴網格蛋白和小窩蛋白，但并非都需要依賴網格蛋白。此外，一種小的GTP結合蛋白-RAC1在促進病毒入胞過程中也發揮關鍵作用，被稱為巨胞飲作用(micropinocytosis)。多項研究報道表明，網格蛋白、小窩蛋白或巨胞飲作用可能在一定程度上影響rAAV的轉導，但它們對于rAAV轉導不是必需的（圖1B）。這提示了，多種內化途徑可能共存，特定內化途徑取決于宿主細胞類型、受體/共受體的特異性及rAAV血清型的不同。
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rAAV進入細胞后，進入早期內涵體(early endosomes, EEs)、晚期內涵體(late endosomes, LEs)和高爾基體(Golgi)中，rAAV進入內涵體是病毒有效轉導的關鍵步驟，rAAV的胞內運輸需要借助內涵體的酸化過程。研究發現，宿主細胞類型和病毒劑量影響rAAV進入內涵體。泛素化-蛋白酶體系統、自噬和內質網相關蛋白降解(ERAD)會影響rAAV轉導，病毒的構象發生變化或衣殼蛋白局部變性，導致病毒能被泛素化，這是病毒顆粒降解的信號。rAAV衣殼蛋白泛素化具有組織特異性，且不同rAAV血清型對泛素化-蛋白酶體系統敏感性不同。蛋白酶體抑制劑可以提高不同rAAV的轉導效率。
目前對于rAAV的入核機制尚無統一結論，主要有兩種不同的看法：其一，rAAV在進入細胞核之前，會從內涵體或反面高爾基體管網狀結構(trans-golgi network, TGN)逃逸到細胞質中，并在核周間隙處(perinuclear space)聚集，裂解，隨后DNA基因組進入細胞核（圖1D）。其二，也有研究認為rAAV通過核孔復合體(nuclear pore complexes, NPCs)以完整的病毒顆粒進入細胞核內，并在核內完成脫殼，而不是被動擴散進入核。一旦進入細胞核，rAAV基因組就從衣殼中釋放出來，也有可能是病毒顆粒在入核之前或期間釋放了DNA基因組。為了實現外源基因的表達，單鏈AAV(ssAAV)基因組可以通過互補鏈合成或堿基配對使正負鏈雜交的方式復制成為雙鏈DNA后表達目的基因，這一過程為rAAV轉導過程中的限速步驟，新合成的中間體dsDNA的穩定性也是一個限制因素。自互補AAV(Self-complementary AAV, scAAV)是在rAAV的基礎上將其編碼區域設計成雙鏈DNA，感染細胞后互補部分互補形成雙鏈DNA，不需等待第二鏈DNA合成，取消了rAAV基因表達的限速步驟，因此scAAV感染后3-5天即可到達表達高峰，同時在部分細胞中觀察到了更高的轉導效率。rAAV DNA基因組的釋放、轉錄及表達取決于rAAV血清型和宿主細胞類型。例如，在Hela細胞中，與rAAV2和5相比，rAAV1是較快在核內脫殼的，但由于DNA基因組釋放效率低，rAAV1的轉導率最低。此外，在小鼠肝臟中，rAAV2、6和8進入細胞核并在核內脫殼的速度類似，但rAAV6和rAAV8的轉導效率明顯更高。
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圖1 rAAV細胞轉導機制
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rAAV侵染細胞時，先與細胞表面特異性受體結合，激活胞內信號通路，進而觸發AAV通過受體介導的內吞作用進入細胞，經過內涵體、高爾基體等細胞器的協助下進入細胞核，病毒裂解釋放基因組，其單鏈DNA需復制成為雙鏈DNA后表達目的基因。了解rAAV細胞轉導機制將有助于更精準地以細胞/組織特異性的方式調控基因的表達，提高rAAV轉導效率，增加臨床試驗中rAAV基因治療的成功。同時，選擇穩定、高質量的病毒包裝體系開展病毒制備亦對基因研究的順利進行至關重要。
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參考文獻
[1]Bijay P Dhungel, Charles G Bailey, John E J Rasko., Journey to the Center of the Cell: Tracing the Path of AAV Transduction. Trends Mol Med. 2021 Feb;27(2):172-184.
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