各位大朋友小朋友兒童節快樂呀，這里是兒童節也想咕咕的椰球。今天為大家帶來的研究是一項功能神經環路研究。論文的標題簡潔明了，為疼痛通過脊髓-臂旁核-中腦環路調控多巴胺神經元。本文發表于自然·神經科學，第一作者是目前就職于浙江大學的楊鴻斌博士。
在本文中，作者鑒定了一條從脊髓出發途徑臂旁核（LPB）投向中腦的神經環路，并揭示了疼痛信號通過該環路調控多巴胺神經元活動的神經機制。研究發現，部分臂旁核神經元接受脊髓上行的傷害感受性信號并將其傳遞給中腦的黑質網狀部（SNR）。而SNR則通過直接和間接兩種不同的機制調控腹側被蓋區(VTA)多巴胺神經元的活動。本研究發現了連接感覺系統和多巴胺系統之間的“橋梁”，有利于幫助我們更深入理解疼痛對學習和認知行為的調控機制。
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引言
疼痛是一種復雜的綜合性現象。狹義的疼痛可能只是一種軀體對傷害性刺激的感覺反應，但臨床上疼痛患者往往還伴有動機行為缺失等負面情緒，甚至會導致焦慮抑郁等心理問題。這提示“疼痛”這一概念除了感覺方面的表現外，還會伴有情緒和認知反應的改變。
位于中腦腹側被蓋區（ventral tegmental area，VTA）的多巴胺（dopamine，DA）神經元在獎賞和和動機行為相關的環路中發揮的作用已經為我們所熟知了。不少研究證據顯示，不論是急性還是慢性疼痛都會導致VTA中多巴胺神經元活動的下降，從而進一步引發疼痛所帶來的負面的情緒反應。然而在這一過程當中尚有一些問題懸而未決。其中最為關鍵的兩個關鍵科學問題是：
01 外周傷害感受器上行的痛覺信號是通過何種通路被傳遞給VTA多巴胺神經元的？
02 疼痛調控多巴胺神經元活動的神經機制是怎樣的？
為了更好地理解疼痛對認知行為的影響，以上這些問題依然值得深入挖掘。
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在痛覺信號的傳入通路中，臂旁核（lateral parabrachial nucleus，LPB）起到了重要的樞紐作用。研究表明，臂旁核可以對多種傷害性刺激產生反應，并將接收到的感覺信息分發到掌管不同生理過程的關鍵腦區，其中就包含了VTA。因此不難作出假設：臂旁核有可能在感覺信號傳輸到多巴胺神經元這一過程中扮演了“中轉站”的角色。
接下來，就讓我們具體來看研究者如何從臂旁核出發，對這條溝通感覺系統和認知系統之間的通路進行解析。
結果
不論是解讀還是設計功能神經環路類的研究，我們大體上可以按照一個“先示蹤，再記錄，最后操縱”的思路對感興趣的科學問題進行分析。具體而言，我們可以首先采用神經示蹤技術鑒定目標神經環路的解剖學結構并利用電生理記錄手段確定該環路的生理基礎；然后使用電生理記錄和鈣成像等記錄手段獲取該環路在特定生理或病理過程中的活動規律；最后使用光遺傳/化學遺傳等手段結合行為學對目標環路的活動進行操縱，從而揭示其與特定生理或病理過程的因果關系。
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回到文中，作者首先對LPB與中腦不同結構之間的解剖學聯系進行了鑒定。值得注意的是，當我們設計神經示蹤實驗研究不同腦區之間的投射關系，尤其是涉及LPB和VTA這樣連接比較復雜的結構時，我們必須同時獲取順向示蹤（anterograde）和逆向示蹤（retrograde）兩種示蹤手段的證據，互相印證才能將各腦區間的解剖學聯系闡明。具體到本文，作者首先采用AAV病毒順向不跨突觸示蹤結合目前非常熱門的熒光顯微鏡光學切片斷層成像系統（fMOST）分別繪制了LPB的谷氨酸能神經元和GABA能神經元向全腦的投射分布（圖1a）。結果顯示LPB的谷氨酸能神經元末梢分別投射向了VTA和SNR（黑質網狀部）的外側（圖1b和c），而GABA能神經元則缺乏向中腦的投射。而在逆向示蹤部分，研究者分別采用了犬腺病毒2（CAV-2）和偽狂犬病毒（RV）兩種不同的手段確定了投向VTA、SNR的LPB神經元的空間定位。結果顯示投向VTA和SNR的LPB神經元在空間上屬于彼此分離的兩群細胞（圖1d和e）。
圖1 臂旁核投射向中腦的功能神經解剖學結果
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?接下來，作者使用離體腦片膜片鉗記錄技術繼續研究LPB向中腦的功能突觸連接。VTA中包含多種不同類型的神經元，其中投射向伏隔核的多巴胺能神經元被認為與獎賞、動機行為相關有著密切的關系。那么，與LPB存在投射的VTA神經元究竟屬于哪種類型呢？為了研究這個問題，作者在LPB的谷氨酸能神經元中表達了光敏感通道ChR2。離體腦片記錄結果顯示，當光刺激激活LPB投向VTA的神經纖維時，VTA中一群投向伏隔核的多巴胺神經元被記錄到了明顯的興奮性突觸后電位（圖1g和h）；而不同的是，在VTA中只有少量GABA能神經元表現出對光刺激的反應（圖1k）。這意味著LPB直接向VTA的投射興奮而不是抑制了VTA多巴胺神經元，與之前研究報道的疼痛會抑制VTA多巴胺神經元活動的結論剛好相反。與此同時，激活LPB投向SNR的纖維也會導致SNR中的GABA能神經元產生EPSCs（圖1h）。
以上實驗結果不得不令人深思，既然LPB向VTA的直接投射對VTA的多巴胺神經元起到的是興奮作用，那么必然存在另外一條環路痛信號轉化為對VTA多巴胺神經元的抑制信號。結合前面的實驗結果，這條環路可能就是LPB投向SNR的環路。因此在后續的實驗中，作者將目光轉移到了這條通路的功能上。
作者首先檢驗了投向SNR的LPB神經元（為了簡明，我們統一將其記作LPB→SNR神經元，對于其他環路也采取相同的記錄規則）是否接受來自脊髓上行的疼痛信號。結合順向和逆向示蹤手段，研究者發現脊髓背角神經元投向LPB的纖維末梢與LPB→SNR神經元存在空間上的重疊（圖2b）。膜片鉗記錄進一步發現光刺激激活脊髓背角投向LPB的纖維可以誘發LPB→SNR神經元產生突觸后電位（圖2d）。這些結果表明由脊髓背角上行的傷害感受性信號會與投射向SNR的LPB神經元產生連接。
圖2 脊髓背角神經元投射向LPB→SNR神經元
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?通過以上實驗，作者成功鑒定了脊髓-LPB-SNR這一連接通路。接下來，作者檢驗該通路能否能夠傳輸傷害感受性信號。為了檢驗這一問題，作者分別采用了光纖鈣成像記錄以及在體電生理記錄結合光標記（Opto-tagging）手段對LPB→SNR神經元群體和個體的活動進行了記錄。結果表明大部分LPB→SNR神經元可以被機械、電、熱等多種傷害性刺激激活（圖3）。而大約半數左右接受LPB投射的SNR神經元同樣可以被傷害性刺激所激活（圖4）。以上發現提示來自脊髓的傷害感受性信號可以通過LPB被傳遞至SNR。
圖3 LPB→SNR神經元可以對多種疼痛刺激做出反應?
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圖4 接受LPB投射的SNR神經元可以被傷害性刺激激活
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?以上研究提示LPB→SNR環路與疼痛存在相關性，那么如果我們特異性抑制LPB向SNR投射通路的活動是否能夠改變動物的疼痛表型呢？為了驗證這一猜想，作者在雙側LPB表達抑制性的光蛋白NpHR，并將光纖埋置在SNR。在兩種經典的疼痛模型（福爾馬林測試是典型的傷害感受性疼痛模型；坐骨神經分枝選擇性損傷SNL是典型的神經病理性疼痛模型）中，抑制LPB投射向SNR的通路均可以部分阻止動物的疼痛反應（圖5a-j）。而場景偏好實驗則顯示出光刺激抑制LPB投向SNR的通路使得動物形成了疼痛緩解的記憶（圖5k-m）。綜上，光遺傳操縱結合行為學實驗表明，LPB→SNR通路在調控疼痛感受方面扮演了重要的角色。
圖5 抑制LPB→SNR通路可以減少動物對疼痛的行為反應
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在確定LPB→SNR通路與疼痛存在密切聯系后，接下來作者又將目光投向了該通路是如何調控VTA多巴胺神經元的活動這一問題上，這也是本文最重要的問題之一。為了探索該問題，作者再次回到“結構-記錄-操縱”這一循環當中。具體而言，首先利用神經示蹤和離體膜片鉗記錄技術作者發現SNR和VTA之間存在直接和間接兩條不同的連接通路。其中直接通路從SNR出發直接投向VTA，這一通路的激活可以直接抑制VTA的活動（圖6a-c）。而間接通路則從SNR投回LPB，而這群接受SNR投射的LPB神經元也同時投射向VTA多巴胺神經元（圖6e）。SNR的活動可以抑制這群投向VTA的LPB神經元的活動，從而解除后者對VTA多巴胺神經元的興奮作用。兩條通路結構不同，但是均表現出對VTA多巴胺神經元活動的抑制作用。
圖6 接受LPB投射的SNR神經元通過直接和間接兩條通路支配VTA多巴胺神經元
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在解析結構之后，作者繼續分析SNR對VTA多巴胺神經元的兩條投射通路在疼痛中的作用。作者首先利用偽狂犬病毒逆向跨突觸投射的特性在直接投向VTA的SNR神經元中特異性表達ChR2（圖6j）。在福爾馬林誘導的疼痛模型中，激活直接通路神經元可以顯著改善動物的疼痛感受表型（圖6k和i），提示直接通路可以改變動物對疼痛的反應行為。
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同時，結合光遺傳刺激和在體光纖鈣成像記錄，作者發現激活SNR向LPB的投射可以降低VTA向伏隔核的多巴胺釋放（圖7d），這一發現提示間接通路的活動對VTA多巴胺神經元的活動同樣可以起到調控作用。
圖7 SNR→LPB活動可以影響VTA多巴胺釋放
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?至此，通過兩輪“結構-記錄-操縱”的循環，作者有力地證明了LPB→SNR環路接受來自脊髓的疼痛信號并參與疼痛感受行為的調控。同時，該通路還通過直接和間接兩條途徑將傷害感受性信號傳遞至VTA的多巴胺神經元，從而達到調控后者活動的目的。在驚嘆于本文工作量的同時，本文嚴謹的邏輯順序和極為豐富的實驗手段的應用也為我們設計功能神經環路研究提供了良好的參考作用。和元生物推出了福爾馬林測試、SNI或CCI等疼痛模型動物構建及Von Frey痛閾檢測等服務助力疼痛領域研究，年中促銷更是免費贈送假損傷對照動物，歡迎前來咨詢。
