腎纖維化是慢性腎病（CKD）發展的核心病理特征之一，表現為腎間質細胞外基質（ECM）的異常沉積和成纖維細胞的持續激活，嚴重影響患者的腎功能和生活質量。在眾多促纖維化因子中，轉化生長因子-β1（TGF-β1）是公認的腎纖維化主要調控因子。因此，靶向TGF-β1及其下游分子一直被認為是抗CKD藥物開發的重要方向和策略。在長期的生活實踐中，大量的傳統草藥已被用于治療纖維化相關疾病，然而其有效成分及分子機制尚未被完全闡明。黃芫花(Wikstroemia chamaedaphne)因富含抗纖維化天然產物（NPs）被廣泛用于民間藥物治療水腫（腎臟相關疾病最突出的表現之一）。為此，中山大學第一附屬醫院研究團隊圍繞黃芫花展開研究，發現黃芫花粗提物（CE） 在減輕腎纖維化方面表現出顯著效果。進一步分離得到的化合物15（dapnepeduin A, DA）通過靶向Cdc42介導GSK-3β/β-catenin信號通路能夠減弱腎纖維化。從而揭示了DA作為一種天然來源的小分子抗纖維化藥物的巨大潛力，為腎纖維化的治療提供了新的分子靶點和策略。百泰派克生物科技憑借先進的腎臟組織分析技術，為解析腎臟疾病的分子機制、篩選潛在靶點以及評價藥物療效提供了有力支持。下面跟隨小編一起來看看這項研究吧~
1、DA作為腎成纖維細胞活化有效抑制劑的發現
研究觀察到黃芫花粗提物（CE）顯著減輕小鼠腎纖維化，如圖1A所示。在圖1B中，TGF‐β1穩定誘導腎成纖維細胞中α‐SMA的表達和ECM的產生，而CE從5µg/mL開始導致這些纖維化指標的表達呈劑量依賴性下降，表明其抑制腎成纖維細胞的激活的有效活性。
為了進一步追蹤CE中的活性成分，研究人員對其進行了分離并分離出16種二萜（1-16），其中化合物15（dapnepeduin A，DA）的活性最強。在ECM方面，DA在候選化合物中對纖維連接蛋白和I型膠原的抑制效率也最為突出（圖1D）。同時，在MTS實驗中，DA對成纖維細胞呈低毒性，在10µM時細胞存活率為>90%。因此，考慮到療效和安全性，研究人員選擇DA作為有前景的先導物進行進一步的研究。該化合物以劑量和時間依賴性的方式降低了纖維化標志物的表達（圖1E，F）。
綜上所述，證明黃芫花的主要成分DA可以顯著抑制腎成纖維細胞的激活和ECM的產生。
圖1. 在TGF-β1激活的腎成纖維細胞中，DA作為一種有效的抗纖維化化合物
2、DA抑制腎小管細胞上皮-間充質轉化成纖維細胞的活化
活化的腎纖維細胞具有增強增殖和遷移能力，導致腎纖維化病變的產生。因此，研究人員接下來對DA在活化的腎纖維細胞中的作用進行了探究。通過對TGF-β1、血管緊張素II、白細胞介素17、脂多糖、白細胞介素-1β等誘導的腎纖維細胞中α-SMA和ECM表達進行研究發現，DA阻斷了α-SMA和ECM的表達且展現出對活化纖維細胞的增殖和遷移能力的抑制作用。同時，DA還被發現能夠抑制上皮間質轉化（EMT）的發生，恢復上皮標記物E-鈣黏蛋白的表達并降低基質標記物（纖連蛋白和微絲蛋白）的表達。DA展現出顯著的抗纖維化活性。
圖2. DA阻斷腎成纖維細胞的活化和腎小管細胞的EMT
3、DA減輕UUO小鼠腎纖維化模型
為了評估DA在體內的抗纖維化作用，研究采用了UUO小鼠模型，手術后7天給予低劑量（LD）和高劑量（HD） DA。與對照組相比，DA顯著下調了UUO小鼠腎臟中Acta2（編碼α‐SMA）、Col1a1、Col3a1（編碼膠原）和Fn1（編碼纖維連接蛋白）mRNA水平以及相應的蛋白質水平（圖3A，B）。低劑量DA組在減少這些纖維化調節因子方面取得了與PFD組（陽性對照組）相似的效力。高劑量DA比PFD組表現出更好的效率，這支持了DA強大的抗腎纖維化活性。從血清肝酶（天冬氨酸轉氨酶（AST）和丙氨酸轉氨酶（ALT））水平和體重下降可以看出，DA給藥并未誘導小鼠明顯的全身毒性（圖3D，E）。
將藥物分配到預定的部位對于提高療效和減少副作用至關重要，因此研究采用了廣泛使用的高效液相色譜-串聯質譜（HPLC - MS/MS）方法來檢測不同器官中的含量。如圖3F所示，在腎臟和肝臟中，在色譜上都發現了DA的峰，并且DA在腎臟中似乎更富集；肺、心、脾均未見DA峰。
綜上所述，DA是一種有效的腎保護劑，可在體內減輕小管間質纖維化，具有較高的療效和安全性。
圖3. DA對UUO小鼠腎纖維化有保護作用
4、DA減少活化成纖維細胞中β-Catenin的積累
為了闡明DA抗纖維化作用的分子機制，研究進行了轉錄組測序。結果顯示，兩組差異表達基因1593個，經DA處理后基因上調1074個，下調519個（圖4A）。KEGG分析顯示，DA對Wnt信號通路發揮了顯著作用，而不是假定的促纖維化TGF-β/Smads信號通路（圖4B）。DA阻斷TGF-β1誘導的β-catenin上調（圖4C）。發現DA顯著抑制TGF-β1刺激的β-catenin細胞質和細胞核積累，Wnt/β-catenin信號激活的主要特征以及纖維化基因轉錄（圖4D，E）。同時，在多個腎成纖維細胞和小管細胞模型中檢測到DA對各種刺激誘導的β-catenin水平的抑制作用。這些發現進一步支持了DA抑制β-catenin對抗腎纖維化。
圖4. DA促進了β-catenin在S33/37/45/T41位點的磷酸化，并促進β-catenin泛素化降解
DA增加了腎成纖維細胞中β-catenin (Ctnnb1) 的mRNA水平，因此假設DA介導的β-catenin的下調可能是由于蛋白質降解。經驗證，DA能促進β-catenin水解（圖4F）。此外，研究團隊還分析了DA對β-catenin泛素化修飾的影響，結果顯示DA處理可挽救TGF-β1還原的β-catenin泛素化（圖4G）。β-catenin的泛素化蛋白水解受到特定位點磷酸化狀態的嚴格控制，例如Ser33/37/45和Thr41位點，研究發現TGF-β1顯著降低了β-catenin在Ser33/37/45/Thr41位點的磷酸化，這可以被DA拮抗從而促進β-catenin的降解（圖4H）。這些研究結果表明，DA通過上調β-catenin 在Ser33/37/45/Thr41殘基的磷酸化促進了β-catenin的泛素化蛋白水解。
這些觀察結果表明，DA的抗纖維化活性主要依賴于對促纖維化β-catenin信號通路的阻斷。
5、DA減輕UUO小鼠腎纖維化模型
為了驗證DA在體內是否也靶向β-catenin信號傳導，研究團隊評估了用載體或DA處理的UUO小鼠腎臟中總β-catenin和磷酸化水平。與培養成纖維細胞的結果一致，DA以劑量依賴的方式降低了UUO腎臟中β-catenin的表達（圖5A）。同時，DA處理可以挽救UUO樣品中β-catenin促降解磷酸化Ser33/37/45/Thr41位點的減少，支持DA促進體內β-catenin泛素化蛋白水解的假設（圖5B）。免疫組織化學染色顯示，在纖維化腎臟中β-catenin升高主要位于小管和小管間質，可以通過給藥DA消除（圖5C）。高劑量DA使UUO腎臟恢復到接近健康小鼠的水平。
圖5. DA增加了UUO腎臟中p-β-catenin (S33/37/45/T41)，降低了總β-catenin含量
6、DA通過抑制Cdc42活性阻斷促纖維化β-Catenin信號傳導
研究采用熱蛋白組學策略進一步研究了DA阻斷纖維化促進的β-catenin信號通路的藥理機制。通過篩選確定了Cdc42可能是DA的靶標蛋白，并發現Cdc42在細胞質中起著重要的信號轉導作用。隨后通過活性Cdc42 pull-down實驗、細胞熱轉移實驗、表面等離子共振（SPR）等驗證了這一結果。此外，利用分子對接和殘基突變實驗發現Leu119和Lys128是DA與Cdc42結合的關鍵位點。這些發現進一步揭示了DA的藥理機制。
圖6. DA直接與Cdc42結合并抑制其活性
7、DA依賴Cdc42調控p-PKCζ/p-GSK-3β/β-catenin軸并發揮抗纖維化活性
使用小干擾 RNA 耗盡成纖維細胞中的Cdc42，此時DA對纖維化的抑制作用減弱；Cdc42過表達可持續促進腎成纖維細胞的活化并阻斷了DA的抗纖維化能力，表明DA的藥效靶點為Cdc42。已知Cdc42 缺失會促進 β-catenin降解，該過程由蛋白激酶Cζ (p-PKCζ )和糖原合酶激酶 3β (p-GSK-3β) 磷酸化減少介導。p-GSK-3β 的減少實際上對應于 GSK-3β 的增加，后者通過在 Ser33/37/Thr41 處磷酸化 β-catenin 引發蛋白水解。因此研究假設Cdc42通過調節p-PKCζ/p-GSK-3β/β-catenin軸來調節腎成纖維細胞活化。驗證的結果與假設結果一致。
圖7. DA通過靶向Cdc42激活了p-PCKζ/p-GSK-3β介導的S33/37/T41位點的β-catenin磷酸化
8、Cdc42表達升高與小鼠和人腎纖維化相關
為了揭示Cdc42與CKD患者腎纖維化的臨床相關性，研究查詢了公共基因表達譜，發現CKD患者的Cdc42轉錄水平遠高于健康供者（圖8B）。此外，Cdc42與纖維化基因Acta2、Col1a、Col3a1、Fn1的表達呈顯著正相關（圖8C）。CKD患者和健康對照者的腎臟標本免疫組化結果顯示，在健康腎臟中，Cdc42在小管和腎小球中少量表達，而在小管間質室中幾乎檢測不到。相比之下，在CKD患者腎臟的小管、腎小球和間質中檢測到Cdc42的顯著增加（圖8D），暗示Cdc42參與腎臟纖維化。綜上所述，這些結果表明Cdc42的高表達與腎纖維化密切相關，因此藥物抑制Cdc42可能有益于CKD患者。
圖8. Cdc42在UUO小鼠和CKD患者中均有較高的表達
研究結論：
DA是一種天然的小分子二萜，它從藥用植物黃芫花中分離出來，是一種高效的抗纖維化藥物，能夠阻斷腎成纖維細胞的激活，減輕小鼠模型中的腎纖維化，它比陽性對照吡非尼酮更有效。從機制上說，DA與Cdc42結合并抑制其活性，從而降低下游p-PKCζ和p-GSK-3β水平，導致p-β-catenin （Ser33/37/Thr41）上調，并通過泛素-蛋白酶體途徑對β-catenin進行蛋白降解。
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參考文獻：
Hu X, Gan L, Tang Z, Lin R, Liang Z, Li F, Zhu C, Han X, Zheng R, Shen J, Yu J, Luo N, Peng W, Tan J, Li X, Fan J, Wen Q, Wang X, Li J, Zheng X, Liu Q, Guo J, Shi GP, Mao H, Chen W, Yin S, Zhou Y. A Natural Small Molecule Mitigates Kidney Fibrosis by Targeting Cdc42-mediated GSK-3β/β-catenin Signaling. Adv Sci (Weinh). 2024 Apr;11(13):e2307850. doi: 10.1002/advs.202307850. Epub 2024 Jan 19. PMID: 38240457; PMCID: PMC10987128.
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