免疫學檢測技術

血清學技術

抗原抗體反應是指抗原與相應的抗體之間發生的特異性結合反應。它既可以發生在體內，也可以發生在體外。在體內發生的抗原抗體反應是體液免疫應答的效應作用。體外的抗原抗體結合反應主要用于檢測抗原或抗體，用于免疫學診斷。因抗體主要存在于血清中，所以將體外發生的抗原抗體結合反應稱為血清學反應或血清學試驗。血清學試驗具有高度的特異性，廣泛應用于微生物的鑒定、傳染病及寄生蟲病的診斷和監測。

2 特點：

（一）特異性和交叉性?抗原抗體的特異性結合是指抗原分子上的抗原決定簇和抗體分子可變區結合的特異性，是由兩者之間空間結構互補決定的?？乖c相應抗體的結合具有高度的特異性，主要依靠抗原分子上的抗原決定簇和抗體末端可變區的氨基酸排列和立體構型，只有抗原決定簇的立體構型和抗體分子的立體構型完全吻合，才能發生反應。如抗新城疫病毒的抗體只能與新城疫病毒結合，而不能與其他病毒結合。但較大分子的蛋白質常含有多種抗原決定簇，如果兩種不同的抗原之間含有部分共同的抗原決定簇，則發生交叉反應。如腸炎沙門氏菌的抗血清能凝集鼠傷寒沙門氏菌。一般來說親緣關系越近，交叉反應的程度越高。根據抗原抗體反應高度特異性的特點，在疾病診斷中可用抗原、抗體任何一方作為已知條件來檢測另一未知方。

（二）敏感性
抗原抗體的結合還具有高度敏感性的特點，不僅可檢測定性，還可以定量檢測微量、極微量的抗原或抗體，其敏感度大大超過當前所應用的化學分析方法。

（三）可逆性
抗原與抗體的結合是分子表面的結合，這種結合是可逆的，結合條件為0℃～40℃、pH4～9。如溫度超過60℃或pH降到3以下，或加入解離劑（如硫*化鉀、尿素等）時，則抗原抗體復合物又可重新解離，并且分離后抗原或抗體的性質仍不改變。免疫技術中的親合層析法，常用改變pH和離子強度促使抗原抗體復合物解離，從而純化抗原或抗體。

（四）反應的二階段性
第一階段為抗原與抗體的特異性結合階段，此階段反應快、僅數秒至數分鐘，但不出現可見反應。第二階段為可見階段，這一階段抗原抗體復合物在環境因素（如電解質、pH、溫度、補體）的影響下出現各種可見反應，如表現為凝集、沉淀、補體結合等。此階段反應慢、需數分鐘、數十分鐘或更久。第二階段受電解質、pH、溫度等因素的影響。

（五）最適比例與帶現象
大多數抗體為二價，抗原為多價，因此只有兩者比例合適時，才能形成彼此連接的大復合物，血清學反應才出現凝集、沉淀等可見的反應現象（圖11-1）。如果抗原過多或抗體過多，則抗原與抗體的結合不能形成大復合物，抑制可見反應的出現，稱為帶現象。當抗體過量時，稱為前帶；抗原過多時，稱為后帶。為克服帶現象，在進行血清學反應時，需將抗原或抗體作適當稀釋，通常是固定一種成分，稀釋另一種成分。

（六）用已知測未知
所有的血清學試驗都是用已知抗原測定未知抗體，或用已知抗體測定未知抗原。在反應中只能有一種材料是未知的，但可以用兩種或兩種以上的已知材料檢測一種未知抗原或抗體。

3 影響因素

（一）電解質
抗原與抗體發生結合后，由親水膠體變為疏水膠體的過程中，須有電解質參與才能進一步使抗原抗體復合物表面失去電荷，水化層破壞，復合物相互靠攏聚集形成大塊的凝集或沉淀。若無電解質參加，則不出現可見反應。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85%～0.9%（人、畜）或8%～10%（禽）的氯化鈉或各種緩沖液（免疫標記技術）作為抗原和抗體的稀釋液或反應液。但電解質的濃度不宜過高，否則會出現鹽析現象。

（二）溫度
在一定溫度范圍內，溫度越高，抗原、抗體分子運動速度越快，這可以增加其碰撞的機會，加速抗原抗體結合和反應現象的出現，如凝集和沉淀反應通常在37℃水浴感作（即將試驗材料加蓋保濕恒溫作用）一定時間，以促進反應現象的出現，若用56℃水浴則反應更快。但有的抗原抗體結合則需長時間在低溫下，才能使反應完成的比較充分、徹底，如有的補體結合試驗在0℃～4℃冰箱結合效果更好。

（三）酸堿度
血清學試驗要求在一定的pH下進行，常用的pH值為6～8，過高或過低，均可使已結合的抗原抗體復合物重新解離。若pH降至抗原或抗體的等電點時，會發生非特異性的酸凝集，造成假象。

（四）振蕩
適當的機械振蕩能增加分子或顆粒間的相互碰撞，加速抗原抗體的結合反應，但強烈的振蕩可使抗原抗體復合物解離。

（五）雜質和異物
試驗介質中如有與反應無關的雜質、異物（如蛋白質、類脂質、多糖等物質）存在時，會抑制反應的進行或引起非特異性反應，故每批血清學試驗都應設陽性對照和陰性對照試驗。

4 實驗方法：

凝集反應（agglutination reaction）

一種血清學反應。顆粒性抗原（完整的病原微生物或紅細胞等）與相應抗體結合，在有電介質存在的條件下，經過一定時間，出現肉眼可見的凝集小塊。參與凝集反應的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。可分為直接凝集反應和間接凝集反應兩類。

直接凝集反應
顆粒狀抗原（如細菌、紅細胞等）與相應抗體直接結合所出現的凝集現象。分為玻片法和試管法。玻片法是一種定性試驗方法。可用已知抗體來檢測未知抗原。若鑒定新分離的菌種時，可取已知抗體滴加在玻片上，將待檢菌液一滴與其混勻。數分種后，如出現肉眼可見的凝集現象，為陽性反應。該法簡便快速，除鑒定菌種外，尚可用于菌種分型、測定人類紅細胞的ABO血型等。試管法是一種定量試驗的經典方法。可用已知抗原來檢測受檢血清中有無某抗體及抗體的含量。用來協助臨床診斷或供流行病學調查研究。操作時，將待檢血清用生理鹽水連續成倍稀釋，然后加入等量抗原，最高稀釋度仍有凝集現象者，為血清的效價，也稱滴度，以表示血清中抗體的相對含量。診斷傷寒、副傷寒病的肥達氏反應（Widaltest）、布氏病的瑞特氏反應（Wright test）均屬定量凝集反應。

間按凝集反應
將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關的、一定大小的顆粒狀載體的表面，然后與相應抗體（或抗原）作用。在有電介質存在的適宜條件下，即可發生凝集，稱為間接凝集反應。用做載體的微球可用天然的微粒性物質，如人（O型）和動物（綿羊、家兔等）的紅細胞、活性炭顆粒或硅酸鋁顆粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯膠乳微球等。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應面積，當顆粒上的抗原與微量抗體結合后，就足以出現肉眼可見的反應，敏感性比直接凝集反應高得多。

沉淀反應(preclpltation reaction)

可溶性抗原與相應抗體結合，在有適量電介質存在下，經過一定時間，形成肉眼可見的沉淀物。沉淀反應的抗原可以是多糖、蛋白質、類脂等。同相應抗體比較，抗原的分子小，單位體積內含有的抗原量多，做定量試驗時，為了不使抗原過剩，應稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應的效價。習慣上將參與沉淀反應的抗原稱為沉淀原，抗體稱沉淀素。沉淀反應的實驗方法大體可分為環狀法、絮狀法、瓊脂擴散法三種基本類型。

環狀沉淀又稱環狀試驗。主要用于抗原的定性試驗。用已知抗體來檢測未知抗原。在小口徑試管中先加入已知抗血清，然后將待檢抗原小心地加在血清的表面，成為界面清晰的兩層。數分鐘后，兩界面交界處出現白色沉淀環，為陽性反應。本試驗常用做抗原定性，如炭疽的診斷（Ascoli氏試驗）、鑒別血跡、媒介昆蟲的嗜血性等。
絮狀沉淀

將抗原與相應抗體在試管內或凹玻片上混勻，如出現肉眼可見的絮狀沉淀物，為陽性反應。如診斷梅毒的康氏反應（Kahntest）。
瓊脂擴散實驗

利用可溶性抗原與抗體在半固體瓊脂內進行擴散，若抗原與抗體對應，并且比例適當，就會出現白色沉淀線，此為陽性反應。瓊脂擴散試驗可在試管內、平皿中以及玻片上的瓊脂中進行。又可分為單向瓊脂擴散試驗和雙向瓊脂擴散試驗兩類。

單向瓊脂擴散試驗
是一種常用的定量檢測抗原的方法。將適量抗體與瓊脂混勻，澆注成板，凝固后，在板上打孔，孔中加入抗原，抗原就會向孔的四周擴散，邊擴散邊與瓊脂中的抗體結合。一定時間后，在兩者比例適當處形成白色沉淀環。沉淀環的直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標準抗原制成標準曲線，則從曲線中可求出標本中抗原的含量。本試驗主要用于檢測標本中各種免疫球蛋白和血清中各種補體成分的含量，敏感性很高。

雙向瓊脂擴散試驗
是將半固體瓊脂傾注于平皿內或玻片上，待其凝固后，在瓊脂板上打孔，將抗原、抗體分別注入小孔內，使兩者相互擴散。如果抗原、抗體相互對應，濃度、比例適當，則一定時間后，在抗原、抗體孔之間出現清晰可見的沉淀線。雙向瓊脂擴散法可用來分析溶液中的多種抗原。一對抗原、抗體系統只能形成一條沉淀線，不同的抗原抗體系統在瓊脂中擴散的速度不同，可在瓊脂中形成不同的沉淀線。本法主要是用于檢測血清中各種免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等。缺點是需要時間過長，靈敏度不高。