常有用戶提到細胞狀態不好，
比如：細胞不再透亮，內部有很多細碎的小黑點，細胞形態異常，培養液變黃…… 這時，除了考慮細菌污染的問題，細胞老化也不容忽視~ 1882年，德國生物學家Weismann曾大膽預測“在細胞水平存在老化現象”。他推測：機體的壽命限制受控于體細胞的分裂能力；在遺傳進化中，不同物種的體細胞獲得了不同分裂的潛能，從而決定了不同物種的壽命長短。 20世紀50年代，Swin和他的同事利用原代細胞體外培養試驗證明了來源于不同物種的纖維細胞均不具備無限分裂的潛能。取得突破性進展的還是Hayflick和Moorhead，他們做了更系統更細致的觀察和描述，他們對25株人成纖維細胞進行原代培養，在這個過程中發現，經過約50次傳代之后，所有細胞出現功能退化，并且喪失分裂能力的現象。此后人們將這一現象稱之為“Hayflick極限”或者自發性老化。之后也有事實證明，細胞老化并不是體外培養所導致，細胞在體內也會隨著年齡的增長，逐步走向老化。 長期的細胞周期阻滯是老化細胞的基本特征，也是體外鑒定細胞老化不可或缺的指標。為了檢查細胞是否躍出了細胞周期，人們通常檢測增殖指示分子Ki-67的表達豐度；或者通過將與胸腺嘧啶相似的溴脫氧尿嘧啶（Bromodeoxyuridine，BrdU）摻入到細胞培養基中，觀察是否有新的DNA合成。細胞老化主要表現為G1期阻滯，個別情況下也可伴隨G2/M期周期阻滯，或直接由G2/M期阻滯誘發形成。 雖然由于細胞周期的中斷和DNA復制的停止，老化細胞內的DNA含量與正常細胞類似，但 RNA與蛋白質豐度均比正常細胞要明顯升高。這是因為，盡管細胞進入老化階段后蛋白質的整體合成速率降低，但是蛋白質的降解體系受到更加明顯的抑制，導致蛋白質在細胞內持續堆積。 無論是原代細胞或是細胞株，在細胞培養過程中細胞老化現象是存在且常見的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細胞會出現的特征包括：細胞增殖變慢、細胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細胞體積增大、細胞扁平、細胞質中出現空泡等現象。 1. 細胞老化最開始的現象通常為細胞內部會出現空泡（可能是凋亡小體），也可能會出現黑點，大多沿細胞周邊排布，內部中間也可能會顯現一些，但相對周邊較少； 2. 老化的細胞會出現細胞體積增大，胞質濃縮，胞膜起泡，皺縮等現象； 3. 老化以后的細胞會出現立體感慢慢消失，開始成扁平狀，細胞與細胞之間的間隔減小或混在一起； 4. 細胞折光性變差，鏡下可見細胞“變薄”，做轉染實驗時，細胞死亡率會較高，但培養液不會發生迅速變黃的現象，仍清亮。（如果是細菌污染的話，一般會出現培養液的迅速變黃，混濁，鏡下可見大量繁殖的細菌；若是支原體污染的話，細胞也會失去正常形態，也有細胞會死亡）； 5. 細胞的貼壁性減弱，開始有細胞漂浮在培養液中； 6. 老化的細胞表面分泌物會增多，細胞表面的純凈度越來越低； 7. 分裂的細胞數量明顯的減少，同時細胞的增殖速度也會大大下降； 8. 細胞開始長角分化。 如下圖： 圖1. HEK293細胞 圖2. MSC細胞 圖1：實心箭頭指示的是發生細胞老化的HEK293細胞，SA-β-gal染色陽性，而空心箭頭指的是未發生老化的細胞。 圖2：被染上藍色的是發生老化的MSC細胞, 未被染色的是未發生老化的細胞。 由圖片可以看出老化細胞體積增大、細胞扁平。 ? 1. 防止細胞老化最主要還是要做到勤觀察、勤換液、勤傳代、勤保種，特別是傳代，不能等細胞太密了之后傳，一般細胞建議長到80％融合度傳代最好； 2. 換培養液應該根據自己細胞消耗培養基的情況來確定是否該換。如果感覺時間不好把握的話就多培養幾瓶細胞，在不同的時間換液，最后再來比較下，看什么時候換液好，得出自己的結論； 3. 選擇正確的血清與培養基：細胞對血清特別敏感，直接影響細胞的生長。一定要選擇適合的血清不然就會因營養物質不協調而導致細胞老化； 4. 在間充質干細胞培養時必然要進行消化，但是消化對細胞的表面蛋白質有很強的破壞作用，因此不能長時間進行消化并且在選擇消化酶時也要選擇較為合適的pH和濃度，不然就會使細胞老化或者分化； 5. 在開始養細胞并傳代時，也要特別注意凍存細胞，以保持細胞有種子庫存在，可以有效避免細胞損傷。 雖然，老化細胞不會立即死亡，但其基因表達會發生變化，如果細胞老化現象嚴重，建議從種子庫或工作庫重新復蘇細胞。 ? 在進行細胞培養時，我們經常會聽到一些專業名詞，原代培養是什么？什么是世代數？細胞系是什么？有限細胞系又代表的是什么？有的專有名詞搞不清楚的話，會對細胞培養過程也會有一定的影響。根據老師們的反饋，我們總結了以下容易混淆的概念供大家參考~ ? ? 原代培養（Primary culture） 開始于直接取自生物體的細胞、組織或器官的培養稱為原代培養。通常代表異質細胞群，很難標準化和繁殖。它們的壽命一般有限，而且已知它們會隨著時間而改變其差異特征。 ? ? 傳代（Passage（Subculture）） ? ? 細胞從一個皿里轉移或傳代到另一皿里的過程稱為細胞傳代。這是一個操作行為，無法準確定義細胞分裂次數。 ? ? 傳代次數（Passage number） 一種細胞被傳代培養的次數稱為傳代次數。 ? ? 世代數（Generation number） 一種細胞所經歷的細胞數量倍增次數稱為世代數。世代數才是衡量評判細胞年輕與否的重要依據。如同樣為P6的細胞其世代數可因傳代密度的差異而相差幾倍。 ? ? 群體倍增時間（Population doubling time） 在對數生長期中期，細胞數量翻倍所需要的時間間隔稱為群體倍增時間。 ? ? 群體倍增次數（Population doubling ） 在培養過程中細胞所經歷的細胞數量倍增次數稱為群體倍增次數。 ? ? 細胞系（Cell line ） 原代細胞經過第一次傳代后增殖的細胞稱為細胞系或亞克隆。隨著細胞的傳代，生長能力最強的細胞會占據優勢，最終導致細胞群體在基因型和表現型上達到一定程度的均一性。 ? ? 細胞株（Cell strain ） 細胞系通過選擇或克隆獲得的具有特征的細胞系稱為細胞株。與親代細胞系起始時相比，細胞株往往會獲得其他一些遺傳學改變。 ? ? 有限細胞系（Finite cell line ） 通過傳代增殖但在體外只能增殖有限細胞數量的一種細胞稱為有限細胞系（通常60-70倍增次數）。 ? ? 衰老（Senescence ） 與染色體端粒縮短相聯系的生物調控的增殖潛力損失稱為細胞衰老。存活的細胞也可能保留一些功能活性。 ? ? 永生化（Immortalization ） 獲得無限的壽命，可能是細胞自發產生的，也可能是以轉染引起的。 ? ? 無限細胞系（Infinite/immortal/strain） 具有無限增殖能力的細胞系或細胞株稱為無限細胞系/連續細胞系。如最常見的Hela，自1951年建系至今在體外存活了70年。 ? ? 平板效率（Plating efficiency） 在傳代培養中產生集落的細胞的百分比稱為平板效率。如果每個集落都可以說是來自一個細胞，那么平板效率等同于克隆效率/集落形成效率。有時，平板效率被粗略地用來描述傳代培養后存活的細胞數量，但這被更好地稱為種子效率。 好啦 今天的介紹就到這里啦 大家若有問題可以通過留言告知 我們會為大家解答噢~ ? References 1. Zhang Ju，Liu Siqi，Xu Ningzhi. General Features and Current Progress on the Research. Chinese Journal of Cell Biological 2013，35(1)：1-16. 2. Gavrilov LA，Gavrilova NS. The Biology of Life Span: A Quanti tative Approach New York: Harwood Academic Pubilshers, 1991. 3. Swim HE, Parker RF. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hygiene 1957; 66(2): 235-43. 4. Martin GM, Sprague CA, Epstein CJ. Replicative life-span of cultivates human cells: Effects of donors’s age, tissue, and genotype. Lab Invest 1970; 23(1): 86-92. 5. Hayflick L. Biomedical gerontology: Current theories of biological aging. Gerontologist 1974; 14(5 pt 1): 454,458. 6. Dice JF. Altered intracellular protein degradation in aging: A possible cause of proliferative arrest. Exp Gerontol 1989; 24(5/6): 451-9. 歡迎關注公眾號留言咨詢，給您最合適的解決方案~ 了解詳細信息可戳原文，轉載請標明出處。
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