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CRISPR/Cas9系統及其應用
隨著CRISPR/Cas9技術的興起，實現了對動植物基因組編輯的廣泛應用。CRISPR/Cas9技術源自Ⅱ型CRISPR/Cas系統，Cas9是一種核酸內切酶，雙tracrRNA:crRNA設計成為單向導序列（sgRNA），其5’端的20個核苷酸序列通過堿基互補配對原則與靶位點的DNA結合，3’端與Cas9蛋白結合。sgRNA與DNA靶序列特異性結合，使Cas9能夠在特異性位點使靶細胞基因組DNA雙鏈斷裂（如圖1）。隨后，靶細胞通過非同源端連接產生InDels，實現基因敲除；或提供dsDNA供體模板通過同源重組修復的方法實現基因的定點突變或是基因插入。對Cas9蛋白關鍵活性位點D10A和H840A進行突變后，使Cas9喪失催化活性但不影響其與目標DNA序列結合的能力。這種突變的Cas9蛋白被稱為dCas9，可應用于CRISPR激活（CRISPRa：dCas9與單個轉錄激活因子VP64連接可激活目的基因），亦可用于CRISPR干擾 (CRISPRi：dCas9與轉錄抑制子KRAB融合后結合到靶基因TSS位點抑制轉錄起始，沉默靶基因的表達) 。
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圖1：CRISPR/Cas9系統的工作流程
Jennifer A. Doudna et al., Science. 2014 Nov 28;346(6213):1258096.
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CRISPR/Cas9系統操作簡單，可針對任何感興趣的靶基因設計不同的sgRNA，且擁有獨特的DNA切割機制、多重靶點識別能力等特點，能夠精確、高效地靶向、編輯、修改、調節和標記各種細胞和生物的基因組位點。CRISPR/Cas9系統的誕生，使堿基編輯、轉錄調控和表觀遺傳編輯、基因組規模的篩選以及細胞和胚胎治療等方面得到廣泛的發展和應用，CRISPR/Cas9文庫的應用也讓基礎研究中大規模的基因組編輯和篩選成為現實。在篩選功能增益方面CRISPRa比較有效；在篩選缺失功能方面CRISPRi文庫較RNAi文庫更有效。
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慢病毒載體是CRISPR/Cas9系統的主要載體之一，因慢病毒有適用宿主范圍廣、感染效率高、具有生物安全性、整合基因到宿主細胞實現長期穩定表達的特點，可實現CRISPR/Cas9文庫對靶細胞有效且準確的基因編輯。下面就一起來了解慢病毒載體和CRISPR/Cas9相關的基因編輯系統如何應用于基礎研究。
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案例1——慢病毒＆CRISPR/Cas9文庫（全基因組文庫）
Elaiophylin triggers paraptosis and preferentially kills ovarian cancer drug-resistant cells by inducing MAPK hyperactivation
作者單位：華中科技大學同濟醫學院
IF:38.104
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精細調節的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路對癌細胞的存活很重要。經前期化合物庫的篩選確定了茶葉素是一種自噬抑制劑。在本研究中證明了茶葉素在多種癌細胞中通過過度激活MAPK通路誘導內質網應激、內質網衍生的細胞質空泡化以及隨后的細胞凋亡的作用。CRISPR/Cas9全基因組敲除文庫篩選鑒定出MAPK通路中的SHP2是茶葉素誘導細胞凋亡的關鍵靶點。細胞熱位移實驗(CETSA)和表面等離子體共振(SPR)實驗進一步證實了SHP2與茶葉素直接結合。通過SHP2敲低或藥理抑制SHP2/SOS1/MAPK通路明顯減弱了茶葉素誘導的細胞凋亡和自噬抑制。茶葉素通過觸發細胞凋亡來克服耐藥性，這提示茶葉素可能為難治性卵巢癌提供一種合理的治療策略。
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圖2：全基因組CRISPR/Cas9敲除文庫篩流程及茶葉素誘導自噬抑制示意圖。
Guan-Nan Li et al., Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022 Sep 12;7(1):317.
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★文庫來源：購買自Addgene (#1000000049)
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和元生物可提供本文所涉及的文庫篩選及慢病毒包裝服務
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案例2——慢病毒＆CRISPR/Cas9文庫（激活文庫）
Genome-wide CRISPR screen identifies MTA3 as an inducer of gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarci
作者單位：天津醫科大學腫瘤醫院
IF:9.756
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臨床胰腺導管腺癌(PDAC)治療失敗的主要原因之一是產生吉西他濱(GEM)耐藥。作者通過CRISPR/Cas9激活文庫篩選發現MTA3介導了PDAC的GEM耐藥，因此MTA3可能成為潛在聯合化療的治療靶點。CRISPR文庫篩選顯示MTA3是GEM處理后存活細胞中富集最多的基因，生物信息學和組織學分析提示其與GEM耐藥高度相關。體內外實驗均證實MTA3可促進胰腺癌細胞對GEM的耐藥。機制上，MTA3作為Mi-2/核小體重塑和去乙酰化酶轉錄抑制復合物的組成部分，抑制NF-κB/p65的轉錄抑制因子CRIP2的轉錄，激活NF-κB信號通路，從而導致GEM耐藥。此外，GEM可通過激活STAT3信號通路上調PDAC細胞中MTA3的表達，從而誘導PDAC對GEM產生獲得性耐藥。MTA3在胰腺癌GEM耐藥中起關鍵作用，有望成為逆轉GEM耐藥的治療靶點。
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圖3：利用CRISPR激活文庫篩選MTA3作為潛在的GEM耐藥相關基因。
Liangliang Wu et al., Cancer Lett. 2022 Aug 15;548:215864.
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★文庫來源：人類CRISPR激活文庫購買自Addgene(#1000000078)
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和元生物可提供本文所涉及的激活文庫篩選及慢病毒包裝服務
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案例3——慢病毒＆CRISPR/Cas9文庫（lncRNA激活文庫）
Lnc-DC promotes estrogen independent growth and tamoxifen resistance in breast cancer
作者單位：杭州醫學院附屬人民醫院
IF:9.685
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選擇性雌激素受體調節劑(SERMs)—他莫昔芬已被證明在雌激素受體(ER)陽性乳腺癌的治療中是有效的。然而，這種內分泌治療的主要障礙是雌激素非依賴性生長導致的耐藥，其潛在機制尚不完全清楚。本研究探討了長鏈非編碼RNA (lncRNAs)是否參與調控ER陽性乳腺癌的雌激素非依賴性生長和他莫昔芬耐藥。研究基于CRISPR/Cas9的SAM(協同激活介質)文庫確定了候選Lnc-DC。通過分析表明，Lnc-DC能夠通過上調抗凋亡基因Bcl2和Bcl-xL來減少他莫昔芬誘導的細胞凋亡。此外，Lnc-DC通過磷酸化(pSTAT3Y705)激活STAT3，隨后誘導細胞因子的表達而激活STAT3，形成自分泌環路。臨床上，Lnc-DC高表達與患者不良預后相關，本研究證明Lnc-DC/STAT3/細胞因子軸在雌激素非依賴性生長導致他莫昔芬耐藥中的功能，Lnc-DC可能是他莫昔芬應答的潛在預測因子。
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圖4：鑒定Lnc-DC參與雌激素非依賴性和他莫昔芬耐藥。
Wan-Xin Peng et al., Cell Death and Disease. 2021 Oct 25;12(11):1000.
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★文庫來源：雙載體SAM文庫，購買自Addgene(#61426、#61425)
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和元生物可提供本文所涉及的lncRNA激活文庫篩選及慢病毒包裝服務
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案例4——慢病毒＆CRISPR/Cas9文庫（定制文庫）
Targeting euchromatic histone lysine methyltransferases sensitizes colorectal cancer to histone deacetylase inhibitors
作者單位：德國癌癥研究中心(DKFZ)
IF:7.316
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結直腸癌(CRC)一個重要的特征是表觀遺傳失調。針對晚期癌癥，表觀遺傳藥物與抗腫瘤藥物結合是一種有前景的治療策略。作者利用合成致死的概念來識別與組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑協同作用以降低CRC生長的表觀遺傳靶點。研究使用針對614個表觀遺傳調節因子定制sgRNA文庫進行CRISPR/Cas9篩選，發現敲除常染色質組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶1和2 (EHMT1/2)顯著增強了臨床使用的HDAC抑制劑的抗增殖作用。通過對1066例不同腫瘤分期的結直腸癌樣本進行組織芯片分析，發現EHMT2蛋白在晚期結直腸癌低表達，且與不良臨床結局相關。機制上，協同抑制HDAC和EHMT1/2可引起減少腫瘤細胞生長的不同機制，包括細胞周期阻滯和自噬的調節。表觀遺傳水平上，這些化合物增加H3K9乙酰化，降低H3K9二甲基化。功能表型上，協同抑制HDAC和EHMT1/2可降低患者來源的CRC類器官腫瘤的活力。
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圖5：聚焦CRISPR/Cas9篩選確定EHMT1和EHMT2敲除對HDAC抑制劑的增敏作用。
Leonhard Valentin Bamberg et al., Int. J. Cancer. 2022;151:1586–1601.
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和元生物可提供本文所涉及的定制文庫篩選及慢病毒包裝服務
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和元生物常用文庫列表
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和元生物體內及體外的功能基因篩選方案
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和元生物可供篩選表型包括
· 腫瘤轉移相關基因篩選-體內
· 細胞遷移/侵襲相關基因篩選-體外
· 細胞克隆形成相關基因篩選-體外
· 細胞增殖相關基因篩選-體外
· 腫瘤耐藥相關基因篩選-體外
· ......
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和元生物一直致力于病毒載體的研制服務，擁有10萬+的病毒包裝經驗/4.6萬+病毒載體庫，包裝GMP級別的病毒質粒。和元生物擁有多種慢病毒包裝系統：三質粒/四質粒包裝系統。
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感恩回饋 突破底價
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