石蠟包埋組織樣品制備方法

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????組織采集后，經固定、保存、石蠟包埋、切片、展片、烤片，方可進行HE染色（或其它化學染料染色）及免疫抗體標記。以下操作依據組織大小及致密程度而定

1、組織的采集、固定和保存：

可依據實驗目的及組織的特點而考慮采用不同的固定和保存方法。此處只介紹實驗室常用方法。

采取組織后，4%多聚甲醛（4%PFA）4°C?固定1小時（根據組織大小和致密程度調整固定時間）或過夜，PBS緩沖液洗三次，每次10min至1小時，于30%、50%乙醇中各10?min至1小時，4°C保存于70%乙醇中。

2、組織的包埋、切片、展片及保存：：

??固定后的樣品經梯度乙醇脫水、二甲苯透明，52-54°C石蠟包埋，常規切片，切片厚4?-10mm，貼于處理過的干凈載玻片上，34°C烤片過夜，之后收集于載片盒中，4°C密封保存。

????石蠟包埋：

保存于4°C?70%乙醇中的組織樣品

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??80%乙醇??15?min

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??95%乙醇?15?min??????

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?100%乙醇??15min?′?2

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1/2乙醇1/2二甲苯?15?min

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????????二甲苯透明??5-10?min

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1/2二甲苯1/2石蠟?30?min

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????石蠟（1）??1.5hr

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????????石蠟（2）??1.5-2.5hr

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石蠟（3）??包埋

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4°C保存

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3、石蠟組織切片的免疫標記：

切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水，即可進行免疫反應，操作步驟與冰凍組織切片的反應方法相同。

石蠟組織切片脫蠟、復水步驟：

??????密封保存于4°C的組織切片

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?????二甲苯(1)??10?min

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?????二甲苯(2)??10?min

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?????二甲苯(3)??10?min

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1/2二甲苯1/2乙醇??15?min

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????100%乙醇??5?min

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?????95%乙醇??5?min

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?????80%乙醇??5?min

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?????70%乙醇5?min

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??????50%乙醇??5?min

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?????30%乙醇??5?min

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????????d2H2O??5?min

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4、石蠟組織切片的HE染色：

???切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水，于蘇木精中室溫染色5-20?min，迅速用水沖洗切片，至組織切片變藍，鏡檢。用0.1-0.5%鹽酸乙醇分色1～2秒鐘，也可用50ml?H2O中加一滴氨水分色，效果亦好（如染色程度恰好，也可省略分色步驟）。之后用流水沖洗切片，直至切片變藍，此稱藍化。切片經梯度乙醇至95%乙醇中，于0.5%伊紅中染色1～5秒或更長時間，95%乙醇洗去殘色，若顏色太深，可在低濃度的乙醇中脫色，鏡檢。無水乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。普通光鏡觀察，室溫干燥條件下保存染色切片。

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石蠟切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水

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??????蘇木精?室溫5-10?min?

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????????H2O??迅速沖洗

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?0.1%鹽酸乙醇??1-2?sec

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??????????流水滴洗

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?????????30%乙醇??1?min

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?????????50%乙醇??1?min

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????????70%乙醇??1?min

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????????80%乙醇??1?min

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????????95%乙醇??1?min

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???????伊紅A液??1min

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