生物素標(biāo)記摩爾比的計(jì)算是基于比爾-朗伯定律（Beer–Lambert law），又稱比爾定律或比耳定律（Beer's law），是分光光度法的基本定律，即當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí)，其吸光度（absorbance，A）與吸光物質(zhì)的濃度（consenreation，C）及吸收層厚度（length，L）成正比, 用公式表示為：A = ε*C* L其中A為光度，ε為摩爾吸光系數(shù),所以此處公式為A 500= ε500 C L（此處ε500=34,000M-1cm-1）
以Frdbio HABA分析法測(cè)算生物素標(biāo)記效率試劑盒（ARL0021T1）為例，
試劑盒組分：
1.HABA溶液： 1ml 10mM in 0.01M NaOH
2.超純親和素（Avidin） 10mg
3.PBS(pH7.2) 30ml 100mM 磷酸鈉，150mM NaCl
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
HABA- Avidin混合液配制：5mg Avidin和300uL 10mM HABA加入到9.7ml PBS溶液中，（合格標(biāo)準(zhǔn)：1cm比色皿A500=0.9 ~ 1.3,）配置好的混合液可以在4℃保存，2周內(nèi)可以正常使用，如果發(fā)現(xiàn)有沉淀或者絮狀物，請(qǐng)過濾或者離心后使用。
實(shí)驗(yàn)操作可以選擇分光光度法或微孔酶標(biāo)板法：
分光光度法：
A． 取900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯，在500nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光值，記錄為A500(H-A);最好測(cè)量三次取平均值；
B． 在比色杯中加入100uL待測(cè)的生物素標(biāo)記蛋白（Biotinylated Protein,簡(jiǎn)稱BP），充分混勻后，在500nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光值，吸光值穩(wěn)定20秒以上，記錄為A500(H-A-BP);最好測(cè)量三次取平均值；如果A500(H-A-BP)<0.35,請(qǐng)稀釋待測(cè)樣品，再次重復(fù)此步驟。
微孔酶標(biāo)板法：
A. 取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光值，記錄為A500(H-A);最好測(cè)量三次取平均值；
B. 在微孔板中加入20uL待測(cè)的生物素標(biāo)記蛋白（Biotinylated Protein,簡(jiǎn)稱BP），震蕩或移液器吹打充分混勻后，在500nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光值，吸光值穩(wěn)定20秒以上，記錄為A500(H-A-BP);最好測(cè)量三次取平均值；如果A500(H-A-BP)< 0.3*A500(H-A),請(qǐng)稀釋待測(cè)樣品，再次重復(fù)此步驟。
標(biāo)記效率計(jì)算方法：
標(biāo)記摩爾比計(jì)算：
生物素：蛋白=[(生物素摩爾濃度*10)/蛋白原始摩爾濃度]*稀釋倍數(shù)
*本試劑僅供實(shí)驗(yàn)室研究使用*
案例演示：
以Frdbio超級(jí)生物標(biāo)記試劑盒（貨號(hào)：ARL0021SK）標(biāo)記Anti-Covid-19 Spike Mab (貨號(hào)：nCoV-S-hMab-B)，標(biāo)記后測(cè)算標(biāo)記比，分光光度計(jì)法。
本案例中被標(biāo)記蛋白為抗體，分子量（MW）為150,000,濃度為5.0mg/mL，A500(H-A)=1.090，A500(H-A-BP)=0.585，
抗體摩爾濃度計(jì)算：mM /mL=5/150000=3.33*10-5
ΔA500=（0.9*1.090）- 0.585=0.396
生物素摩爾濃度計(jì)算：mM /mL=0.396/(34000*1)=1.16*10-5
抗體：生物素（摩爾比）=(3.33*10-5)/(1.16*10-5*10)=1:3.48