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? ? ? ? 暨南大學吳建國教授/潘攀研究團隊，在Nature子刊《Nature Communication》發表題為“SARS-CoV-2 N protein promotes NLRP3 inflammasome activation to induce hyperinflammation”（DOI: 10.1038/s41467-021-25015-6 ），該研究展示了SARS-CoV-2 N蛋白通過促進NLRP3炎癥小體激活誘導高炎癥反應；N蛋白促進促炎因子的成熟，并誘發細胞和小鼠的促炎反應；N蛋白直接與NLRP3蛋白相互作用，促進NLRP3與ASC結合，促進NLRP3炎癥小體組裝；N蛋白加重膿毒癥和急性炎癥小鼠模型中肺損傷，加速死亡，促進小鼠IL-1β和IL-6激活。
SARS-CoV-2 N蛋白誘導細胞和小鼠促炎反應
? ? ? ? 首先，SARS-CoV-2感染巨噬細胞和樹突細胞(DCs)后多種促炎因子趨化因子及配體均有不同程度增加；研究人員對SARS-CoV-2蛋白對IL-1β釋放的影響進行研究，WB結果顯示N蛋白在HEK293T細胞表達最高(Fig.1c)，ELISA結果顯示N蛋白表達的HEK293T-NLRP3炎癥小體體系IL-1β最高(Fig.1d)，SARS-CoV-2 N蛋白加強Nigericin誘導的IL-1β分泌(Fig.1e)。因此SARS-CoV-2 N蛋白在IL-1β成熟及分泌中發揮重要作用。N蛋白介導THP-1包含IL-1β在內的炎癥因子表達， MCC950(NLRP3特異性抑制劑)可以抑制上述炎癥因子的表達(Fig.1g)。利用AAVlung-N在小鼠肺中表達N蛋白，AAVlung-N可以顯著增加IL-1β，IL-6，TNF，CXLC10，CCL2，IL-11，IL-7和CXCL8的mRNA表達，另外Ac-YVAD-cmk(Caspase-1抑制劑，阻斷IL-1β成熟)和MCC950對AAVlung-N誘導的上述因子表達均有不同程度的恢復作用(Fig.1h&1i)。因此，研究人員推測N蛋白促進NLRP3炎性小體激活，從而誘導成熟IL-1β分泌，進而在誘導炎癥因子和細胞因子中發揮關鍵作用。結果表明，SARS-CoV-2 N蛋白在誘導促炎因子中發揮關鍵作用，N蛋白可能參與調節NLRP3炎癥小體的激活。
Fig. 1 SARS-CoV-2 N蛋白誘導炎癥反應
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SARS-CoV-2 N蛋白誘導IL-1β成熟和IL-6產生
? ? ? ?考慮到激動劑對促炎因子表達的主導作用，接下來研究人員對SARS-CoV-2 N蛋白在IL-1β成熟中的作用進行研究。研究發現N蛋白可以促進IL-1β的分泌、IL-1β cleavage和Caspase-1成熟且呈現劑量依賴，LPS+ATP和LPS+Nigericin均可誘導IL-1β的分泌和cleavage，N蛋白可以進一步促進IL-1β的分泌和cleavage(Fig.2a&2b)。LPS+ATP和LPS+Nigericin可以促進THP-1細胞IL-18和IL-6，N蛋白僅能促進IL-6的分泌，不能促進IL-18的分泌，MCC950抑制IL-1β和IL-6分泌；LPS+ATP或LPS+Nigericin同樣可以促進BMDM細胞的IL-1β和IL-6的分泌，并且在NLRP3-/-小鼠BMDM中LPS+ATP或LPS+Nigericin對IL-6和IL-1β分泌并無顯著促進作用(Fig.2c-2j)。綜上所述，N蛋白誘導IL-1β的成熟和IL-6的產生，并揭示NLRP3是N誘導IL-1β分泌和IL-6產生所必需的，因此N蛋白可能在NLRP3炎癥小體的激活中發揮重要作用。
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Fig.2 N蛋白誘導IL-1β成熟和IL-6生成
SARS-CoV-2 N蛋白與NLRP3交互作用
? ? ? 接下來研究者對SARS-CoV-2 N蛋白在NLRP3炎癥小體調控中的作用進行研究。CO-IP結果顯示，N蛋白僅與NLRP3蛋白相互作用，且His-N蛋白可以直接與NLRP3蛋白結合(Fig.3a-3e)，N蛋白和NLRP3共定位于細胞質中，N蛋白與ASC無交互作用(Fig.3f-3i)。所以，N蛋白特異性與NLRP3蛋白相互作用，調節NLRP3炎癥小體分泌。
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Fig.3 SARS-CoV-2 N蛋白與NLRP3蛋白相互作用
N蛋白參與NLRP3炎癥小體激活
? ? ? ?通過評估N蛋白的截短突變體N1-N8，鑒定參與NLRP3相互作用的SARS-CoV-2 N蛋白序列。結果表明，NLRP3蛋白與N1、N5、N6和N7相互作用，并且IL-1β分泌、IL-1β cleavage和Caspase-1 p20 maturation 亦受N蛋白N1、N5、N6和N7影響(Fig.4a-4e)，因此，N蛋白260aa-340aa截短體參與了與NLRP3的相互作用并激活NLRP3炎癥小體。
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Fig.4 N蛋白截短體參與NLRP3炎癥小體激活
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N蛋白促進NLRP3與ASC的相互作用
? ? ? ?接下來研究人員對N蛋白在調節NLRP3炎癥小體成分中的作用進行研究。結果顯示，N蛋白對NLRP3、Caspase-1和ASC的蛋白水平沒有影響，然而NLRP3存在時N和ASC可以相互免疫沉淀(Fig.5a-5e)。因此，該結果提示N蛋白、NLRP3和ASC三個蛋白可能形成一個復雜的N-NLRP3-ASC復合物。N蛋白增強NLRP3與ASC的相互作用在HEK293T和A549細胞并呈劑量依賴(Fig.5f-5g)。同樣，在PMA-differentiated THP-1-N細胞中，Nigericin促進 N蛋白在NLRP3存在的情況下與內源性ASC相互作用(Fig.5h)。因此，SARS-CoV-2 N 促進NLRP3與ASC的相互作用。
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Fig.5 N蛋白促進NLRP3與ASC的相互作用
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SARS-CoV-2 N蛋白促進NLRP3炎性小體組成
? ? ? ?對NLRP3在細胞質中進行定位，NLRP3呈彌散狀分布于細胞質，而SARS-CoV-2 N蛋白存在時，NLRP3呈聚集的斑點狀(Fig.6a)，SARS-CoV-2 3a蛋白與NLRP3共定位，但未能形成斑點狀聚集。SARS-CoV-2 N2和N8 截短體，同時分布在細胞核和細胞質中且不能與NLRP3和共定位，NLRP3在HEK293T細胞的細胞質中未形成斑點狀聚集(Fig.6b&6c)。THP-1細胞中NLRP3分布與HEK293T細胞和A549細胞幾乎一致，且N蛋白存在時，內源性NLRP3蛋白在細胞質中聚集形成斑點(Fig.6d&6e)。因此，SARS-CoV-2 N蛋白可能促進NLRP3炎癥小體復合體的形成。
THP-1細胞和BMDM細胞中，Nigericin刺激內源性ASC蛋白oligomerization，并且N蛋白可以促進這一反應(Fig.6f&6g)。此外，HEK293T-NLRP3細胞分別轉染編碼SARS-CoV-2-N蛋白及其截短突變體，ASC oligomerization被N1、N5、N6和N7蛋白激活，而不受N2、N3、N4、N8蛋白影響(Fig.6h)。所以，N蛋白序列260aa-340aa與NLRP3相互作用，促進ASC oligomerization。
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Fig.6 N蛋白促進NLRP3聚集和ASC oligomerization
? ? ? ?此外，研究人員還探究了N蛋白對NLRP3炎癥小體復合物組裝的影響。將HEK293T細胞或A549細胞共轉染不同質粒，GFP同時分布于細胞核和細胞質中，NLRP3彌散狀分布于細胞質(Fig.7a&7b(a-e));N蛋白和NLRP3表達時，NLRP3與N蛋白共定位，呈斑點狀(Fig.7a&7b(f-j));GFP和ASC表達時，GFP與ASC同時分布于細胞核和細胞質中，并形成小的環狀結構(Fig.7a&7b(k-o))；N蛋白和ASC表達時，N蛋白和ASC無法共定位(Fig.7a&7b(p-t))；GFP、ASC和NLRP3同時表達時，NLRP3和ASC共定位于細胞質并形成環狀結構(Fig.7a&7b(u-y))；值得注意的是，當N蛋白、ASC和NLRP3同時表達時，3種蛋白共定位形成球狀結構(Fig.7a&7b(z-d))；當3a、ASC和NLRP3同時存在時，3種蛋白共定位未能形成球狀結構(Fig.7a&7b(ae-ai))。綜上所述，SARS-CoV-2 N蛋白促進NLRP3炎性小體復合物組裝，而非SARS-CoV-2 3a蛋白。
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Fig.7 N蛋白促進NLRP3炎性小體組裝
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N蛋白激活NLRP3炎癥小體誘導小鼠肺損傷
? ? ? ?接下來，研究人員對SARS-CoV-2 N蛋白在激活NLRP3炎癥小體的生物學作用進行評價。通過在C57BL/6小鼠表達N蛋白，探究N蛋白在肺損傷中的作用。注射AAVlung-N的小鼠，血清中IL-1β和IL-6的水平明顯高于對照組，且Ac-YVAD-cmk和MCC950均可抑制該反應(Fig.8a&8b)，但AAVlung表達N蛋白并未影響血清中IL-18的表達(Fig.8c)。AAVlung感染的小鼠肺部免疫熒光結果顯示，AAVlung-N小鼠肺部IL-1β和IL-6表達明顯高于其他分組，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可降低IL-1β和IL-6表達(Fig.8d&8e)。HE染色顯示，攜帶AAVlung-N的小鼠肺部有明顯的的炎癥病變及組織損傷，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可抑制肺組織的病變(Fig.8f)。這些結果表明NLRP3炎性小體是N蛋白誘導的小鼠肺損傷發生所必需的。
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Fig.8 N蛋白激活NLRP3炎癥小體誘導小鼠肺損傷
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? ? ? ? ELISA結果顯示，AAVlung-N誘導NLRP3+/+小鼠IL-1β和IL-6的表達，在NLRP3-/-無明顯影響，說明NLRP3在N蛋白介導的IL-1β和IL-6激活中不可或缺(Fig.9a&9b)，對IL-18激活沒有影響（Fig.9c）。并且攜帶AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺組織免疫組化結果IL-1β和IL-6的表達明顯高于NLRP3-/-小鼠(Fig.9d&9e)。HE病理染色同樣顯示攜帶AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺部有明顯的炎癥病變及組織損傷(Fig.9f)。因此，N蛋白通過激活NLRP3炎癥小體誘導小鼠全身炎癥，引發肺損傷。
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Fig.9 NLRP3在N蛋白誘導的肺損傷中發揮重要作用
? ? ? ? 綜上所述，研究人員揭示了COVID-19的病理機制，其中SARS-CoV-2 N蛋白通過促進NLRP3炎癥小體的激活從而促進炎癥和肺部損傷。
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Fig.10 N蛋白通過激活NLRP3炎癥小體誘導肺損傷模型
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結論
? ? ? ?在該研究中，研究人員通過分析GEO數據庫(GSE155106)發現SARS-CoV-2感染巨噬細胞和DCs會促進大量細胞因子和趨化因子的表達。通過篩選，研究人員發現SARS-CoV-2 N蛋白通過激活NLRP3炎性小體，促進炎癥因子的表達導致小鼠肺損傷，加重膿毒癥模型小鼠的死亡。N蛋白直接與NLRP3作用，促進NLRP3炎性小體聚合，從而激活NLRP3炎性小體。綜上所述，該研究結果證實SARS-CoV-2 N蛋白通過NLRP3炎癥小體誘導肺損傷的新機制。
