隨著研究的不斷深入，現代神經科學需要關注大量不同種類的神經元或膠質細胞，進行精細研究，除了特異性啟動子的應用外，還可以借助多種Cre小鼠模型配合DIO病毒策略或flox小鼠策略以實現特異性操作神經元的目的。
Cre-LoxP系統
來源于噬菌體P1的Cre/loxP系統主要包括2個重要組成部分：一個是loxP位點，另一個就是可以對loxP位點進行識別的Cre酶，使兩個loxP位點間發生基因重組，實現對目的基因刪除、翻轉、易位和序列互換。在神經科學領域，此技術可以用于對神經環路的特異性標記、特異細胞類型中內源基因的功能研究及構建小鼠模型等。(更多Cre體系相關內容，可參考【知識分享】一半海水、一半火焰，分子表達操控中高頻出現的Cre、Flp、Dre等重組酶系統如何工作)
Cre鼠策略
利用基因敲入手段，借助CRISPR/Cas9技術，將Cre重組酶定點插入到小鼠基因組中，獲得可特異性在某類神經元中表達Cre的工具鼠，從而可以配合AAV-DIO病毒載體，做到精準操控神經元的目的，亦可以和多種Flox鼠搭配使用，研究不同基因的功能。
以Thy1-iCre工具鼠為例構建策略
錐體細胞是大腦皮層內最主要的興奮性神經元，所有的皮層信息傳出都是由錐體神經元攜帶的，參與條件性恐懼反射（fear conditioning）、學習記憶（learning and memory）、感覺和運動（sensorimotor process）信息的處理等多種生理過程，在神經退行性疾病動物造模及神經損傷研究中均發揮重要作用。
Thy1是錐體神經元的特異性啟動子，在前腦、海馬、杏仁核、丘腦及視網膜等區域均有豐富的表達， Thy1-cre鼠配合重組AAV病毒可在以上腦區實現細胞特異性標記、光遺傳學和化學遺傳學操縱、在體鈣成像記錄，或者組織特異性的基因編輯。
Thy1-Cre鼠應用策略
1、Thy1-Cre鼠配合AAV-DIO- DREADD病毒載體，操縱杏仁核BLA區Thy1陽性細胞改變恐懼記憶的消退和維持
在杏仁核中，Thy1陽性的細胞集中分布在基底外側部（basolateral），而Thy1陰性的細胞則廣泛分布于整個杏仁核。這兩類神經元在恐懼記憶的形成、消退（extinction）和消退維持（retention）中分別起到了不同的作用。其中Thy1陽性標記的細胞表現出對恐懼抑制或者被稱為“恐懼-關（Fear-Off）”神經元的特性[1]。
在Thy1-Cre鼠BLA注射興奮性化學遺傳學病毒AAV-DIO-Gs-DREADD-IRES-mCherry，同時以AAV-CaMKII-eYFP作對照，可見Gs- DREADD的表達局限在BLA，但是對照病毒的熒光則廣泛地分布在整個杏仁核。在動物進行恐懼消退和消退維持實驗前30 min于腹腔注射CNO。結果顯示，在恐懼消退過程中，使用化學遺傳手段增強BLA Thy1神經元的興奮程度雖然使動物的恐懼行為出現下降，但相比對照動物這一變化在統計上并未表現出顯著。然而在恐懼消退維持測試中增強BLA Thy1神經元的興奮程度可以使動物的恐懼行為顯著下降，這提示增加BLA Thy1陽性神經元的活動有助于恐懼記憶消退的鞏固。
AAV-DIO-Gs-DREADD注射于Thy1-Cre鼠
2、基于Thy1-Cre工具鼠追蹤直接投射到腹側和背側海馬CA1區的圖譜
在Thy1-cre工具鼠的腹側海馬（vCA1）和背側海馬（dCA1）先后注射表達綠色熒光的Helper病毒和表達紅色熒光的RV病毒，同時感染2種病毒的起始神經元（starter cell）共標記為黃色[2]。
Thy1-Cre配合AAV helper和RV病毒實現神經元跨單突觸標記
3、條件性敲除BIN1改變神經元活動性
使用Thy1-Cre鼠和Bin1flox/flox鼠雜交，從而在興奮性神經元中特異性地敲除Bin1基因。使用c-Fos染色標記活動的神經元數量。結果表明，在引入外界刺激的情況下，在海馬及壓后皮層中對照組小鼠的c-Fos陽性細胞數量均顯著高于Bin1敲除組。但是在將動物暴露在新環境后，Bin1敲除鼠齒狀回的c-Fos陽性細胞數量高于對照鼠。以上結果表明，在興奮性神經元中敲除Bin1可以改變神經元的活動[3]。
Thy1-Cre鼠和flox鼠雜交實驗條件性敲除目的
錐體神經元參與多種生理過程，而Thy1-Cre工具鼠的出現可實現特異性針對錐體神經元操控，是一項重要的實用技術手段，目前，和元生物已制備成熟的Thy1-Cre小鼠，同時，為配合Cre鼠的多種應用策略，和元現推出Cre鼠+AAV病毒打包促銷活動：
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病毒載體介導的Cre/loxP系統
相較于轉基因小鼠，借助病毒載體介導的Cre系統實現特異性操作神經元或基因的目的，同時可以大大縮短實驗的周期，另外，多種多樣的病毒載體，可以最大限度的滿足各類實驗的需求。各類病毒載體的特點如下：
Cre-loxp系統的應用
可以借助Cre品系的小鼠和Cre依賴表達的病毒載體結合使用，達到特異性對某些細胞的標記和操控目的。運用神經示蹤技術對大腦特定神經環路的結構和功能進行解析時，亦可以借助Cre重組酶系統和AAV血清型（比如rAAV2/9、rAAV2/retro、rAAV2/1）結合適用，達到特異性對神經環路標記和功能研究的目的。
基于rAAV1-Cre順行單級跨突觸示蹤
（Zheng P’s lab., Sci Adv., 2019[4]）
在實際進行實驗課題過程中，病毒載體輔助和Cre小鼠的配合使用即有互補性，又能相互驗證，成為動物體內研究尤其是神經科學領域研究中不可或缺的助力。
參考文獻
[1] Nat Commun. 2016 Oct 21;7:13149.doi: 10.1038/ncomms13149.
[2] Front Neural Circuits. 2021 Apr 14;15:643230.doi: 10.3389/fncir.2021.643230.
[3] PLoS One. 2019 Aug 13;14(8):e0220125.doi: 10.1371/journal.pone.0220125
[4] Sci Adv. 2019 Feb 20;5(2):eaat3210. doi: 10.1126/sciadv.aat3210.