新生兒的器官經歷了組織生長和功能成熟的過程，以適應其功能需求和環境刺激。肝臟是胚胎早期的造血器官，在成年后轉變為以代謝功能為主，并伴有表觀遺傳修飾的廣泛變化。盡管對于胚胎期細胞類型鑒定和肝臟器官發生的初始階段有了一定了解，但對于出生后肝臟發育和功能成熟的調控知之甚少。

RNA修飾最近被認為是表觀遺傳學的新關注點，N⁶-methyladenosine（m6A）是真核生物mRNA上最常見的一種轉錄后修飾，介導了超過80%的RNA堿基甲基化。其中甲基化轉移酶（methyltransferase，也叫Writers）是一類重要的催化酶，能夠讓mRNA上的堿基發生m6A甲基化修飾，而METTL3作為m⁶A甲基化轉移酶的核心蛋白參與發揮重要功能。目前對于Mettl3在維持某些器官穩態中的作用進行了廣泛的研究，然而Mettl3/m⁶A介導的表觀轉錄組學機制在出生后肝臟發育中的確切作用仍然存在爭議。

研究成果

2023年5月15日，山東大學基礎醫學院袁得天教授、高等醫學院研究院李石洋教授、武漢大學基礎醫學院夏宇塵教授及德國海德堡癌癥研究中心Mathias Heikenwalder合作在Nature Metabolism雜志在線發表新的研究論文“m⁶A modification-tuned sphingolipid metabolism regulates postnatal liver development in male mice”。該項研究揭示了m⁶A修飾的鞘脂代謝可以調節小鼠出生后的肝臟發育和代謝穩態，并探討了Mettl3/m⁶A/Smpd3軸對鞘脂代謝的精細調控。

結果

01 Mettl3在出生后肝臟發育過程中表達降低

首先，研究團隊基于轉錄組數據分析和差異基因分析發現，m⁶A甲基轉移酶復合體的核心催化酶Mettl3和Mettl14隨著肝臟發育過程而表達下降。其中，Mettl3主要表達在肝細胞中，研究發現，成年肝臟中肝細胞的Mettl3的表達遠低于胚胎或者新生兒肝臟肝細胞中的表達（圖1）。

圖1 Mettl3在胚胎和新生兒肝臟中高表達，并在出生后肝臟發育過程中下降

02 Mettl3參與肝臟發育和功能成熟

因此，為研究m⁶A修飾在肝臟發育中的作用，研究者構建Mettl3^ΔHep小鼠，胚胎期特異性在肝臟中敲除Mettl3（圖2a,b）。結果顯示，肝臟Mettl3基因的缺失導致m⁶A RNA水平降低，且Mettl3^ΔHep小鼠在發育過程中表現出生長遲緩，同時，Mettl3^ΔHep小鼠的血清谷丙轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）升高，肝臟組織表面粗糙，出現肝損傷表型（圖2c-h）。進一步研究發現，Mettl3^ΔHep小鼠肝臟組織中肝細胞肥大，細胞凋亡顯著增加（圖2i-m）。這些結果提示了特異性在肝臟中敲除Mettl3基因導致肝細胞代謝重塑和肝臟功能成熟缺陷。

圖2 肝臟Mettl3缺失導致肝細胞肥大、肝損傷和生長遲緩

隨后，研究人員借助rAAV2/8-TBG-Cre注射1周齡Mettl3-floxed鼠（AAV8-Cre鼠），條件性敲除肝臟中Mettl3基因，結果并未觀察到小鼠肝臟出現明顯的損傷（圖3a-c）。繼續觀察發現，3周齡的AAV8-Cre鼠肝臟m⁶A水平未表現出明顯的降低（圖3d-f）。這提示了Mettl3基因敲除對肝臟代謝穩態的影響與敲除時間點有關，在新生小鼠4周前，Mettl3介導的m⁶A修飾對于肝臟發育及功能成熟至關重要。

圖3 小鼠出生后誘導肝細胞Mettl3表達下調不會引起肝損傷

03 MeMettl3/m⁶A/Smpd3軸對鞘脂代謝的精細調控機制

為進一步確定與發育缺陷密切相關的潛在靶基因，研究團隊借助轉錄組分析及分子生物學技術發現，Mettl3^ΔHep小鼠肝臟中神經鞘脂酰胺代謝的中性鞘脂酶Smpd3 mRNA水平和蛋白表達明顯上調（圖4）。

圖4 Mettl3^ΔHep小鼠肝臟發生鞘脂代謝重塑

進一步研究發現，Mettl3^ΔHep小鼠肝臟中Smpd3 mRNA上的m⁶A修飾水平顯著降低；而AAV8-Cre鼠肝臟中Smpd3轉錄水平從出生后4周開始增加，與出生后m⁶A水平呈負相關（圖5i-l）?？偟膩碚f，小鼠出生后發育早期的肝臟Mettl3缺失導致Smpd3過早高表達，這是由于依賴Mettl3介導m⁶A修飾的RNA衰變缺陷造成的，在新生小鼠4周前，較高水平的Mettl3/m⁶A可作為制動器，阻礙了Smpd3的過早表達（圖5）。

圖5 Mettl3通過m6A修飾調控smpd3 mRNA衰變

接下來，作者探究了鞘脂代謝異常與Mettl3缺乏誘導的肝損傷之間的關系，借助液質聯用（HPLC-MS）分析和電鏡結果發現，Mettl3^ΔHep小鼠肝臟中毒性神經酰胺堆積，線粒體損傷和內質網應激升高（圖6）。

圖6 Mettl3^ΔHep小鼠肝臟中毒性神經酰胺堆積，線粒體損傷和內質網應激升高

04 下調Smpd3的表達有效改善肝臟發育和功能成熟缺陷

基于上述結果，作者分別借助Smpd3拮抗劑GW4869、Smpd3 siRNA和AAV過表達Sgms1（pAAV-CBh-Sgms1-3Xflag-P2A-EGFP-WPRE）以抵消Smpd3的方式下調Smpd3的表達（圖7a，圖8a），發現Smpd3表達降低，可有效逆轉由Mettl3缺乏引起的肝損傷，神經酰胺堆積、肝線粒體變性和內質網異常得到了改善，小鼠體重也部分恢復（圖7-8）。

圖7 藥理學手段抑制Smpd3可減輕Mettl3缺陷引起的神經酰胺累積和肝損傷表型

圖8 Smpd3敲低可減輕肝臟Mettl3缺陷引起的神經酰胺累積和肝損傷表型

結論

本文借助轉錄組學、高通量測序、轉基因小鼠、rAAV載體介導的條件性敲除、分子生物學等多種技術手段發現Mettl3基因的缺失導致肝細胞代謝重塑和功能成熟缺陷，且對肝臟代謝穩態的影響與基因敲除時間點有關。Smpd3作為Mettl3的靶標，參與鞘脂代謝的調控。Mettl3缺失導致Smpd3表達上調，進而介導鞘脂代謝重新連接，并伴隨著毒性神經酰胺堆積以及線粒體損傷和內質網應激升高。在新生小鼠4周前，較高水平的Mettl3/m⁶A可作為制動器，通過嚴格調控Smpd3，保護出生后的肝臟免受過度鞘脂積累和代謝紊亂的影響。這項研究擴展了m⁶A修飾在維持發育階段肝臟代謝穩態中的關鍵作用，為新生兒健康和肝臟發育的理解提供了強有力的支持。

該研究由山東大學基礎醫學院袁得天、高等醫學院研究院李石洋、武漢大學基礎醫學院夏宇塵以及德國海德堡癌癥研究中心 Mathias Heikenwalder 教授合作完成。山東大學基礎醫學院博士生王士冠、碩士生韓盼、青年教師孫建峰、深圳市呼吸疾病研究所研究員陳善澤為論文共同第一作者。

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