1. 樣品制備:包涵體蛋白樣品
1.1 將誘導表達結束后的培養物轉移到離心管中,8,000rpm,離心15min收集菌體,然后加入1/10體積的裂解緩沖液(50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,10 mM imidazole pH 8.0,1mM PMSF) ,加入0.2~0.4mg/ml溶菌酶。
(PMSF很容易降解,在破菌前加入,同時還可加入不影響目的蛋白與樹脂結合的蛋白酶抑制劑。)
1.2 將菌體沉淀懸浮起來(如果菌液濃度高,也可考慮加入10μg/ml?RNase A和5μg/ml?DNase?I),混勻,放置于冰上,然后冰上超聲破碎細胞。
1.3 將破碎液轉移至離心管中,10,000rpm,4℃離心20~30min,去掉上清,沉淀為包涵體。
1.4 步驟1.2和1.3可以重復一次。
1.5 按照原菌體:包涵體溶解緩沖液(50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,10 mM imidazole,8M尿素,pH 8.0)=1:10(W/V)將包涵體懸浮溶解,此為包涵體溶液。
(包涵體溶液可用于變性條件下His標簽蛋白的純化。)
2. 樣品純化
純化方法與“重組蛋白的純化——可溶性蛋白純化(NI)”里介紹的His標簽融合蛋白Ni-NTA的純化方法完全相同,不同點在于純化過程所有溶液都在上述實驗基礎上都添加8M尿素。
