NLRP4E是核苷酸結合寡聚化結構域、富亮氨酸重復序列和含pyrin結構域（NLRP）家族的重要成員，能夠調節病理生理過程，被認為是“雌性生育因子”之一，也是卵母細胞減數分裂中必不可少的典型母體因子。它通過調節關鍵的肌動蛋白帽蛋白類固醇受體共激活因子（SRC）和細胞分裂控制蛋白42同源物（CDC42）在卵母細胞減數分裂中發揮重要作用。同時，NLRP4E被認為是蛋白皮層下母體復合體（SCMC）的一個新亞基，也有文獻研究表明NLRP4E對著床前胚胎發育很重要，但其在卵母細胞減數分裂中的功能及調控機制尚不明確。對NLRP4E的深入研究有望揭示其在生殖過程中更廣泛的作用與潛在應用價值。安徽醫科大學第一醫院張東教授課題組通過構建NLRP4E基因敲除的卵母細胞模型，結合分子生物學、活細胞成像及蛋白質組學等先進技術，全面探究了 NLRP4E在卵母細胞減數分裂過程中通過SRC和CDC42調控肌動蛋白帽的形成的具體分子機制，為生殖調控網絡的研究和生殖障礙治療靶點的開發提供重要依據。此研究依賴于精確的蛋白質互作分析，百泰派克生物科技與安徽醫科大學課題組緊密合作。采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質譜平臺結合nanoLC-MS/MS納升色譜，幫助進行了高效、精準的Co-IP蛋白互作分析服務，保障了數據的準確性與可靠性，進一步推動了該研究的深入開展。作為生物質譜優質服務商，百泰派克生物科技為客戶提供Co-IP免疫共沉淀法蛋白互作分析一站式服務。
一、研究方法
1、建立細胞模型
以雌性小鼠的卵母細胞為研究對象。從卵巢中分離的卵母細胞被體外培養至減數分裂階段，模擬其自然發育過程，為后續研究提供可靠的實驗模型。
2、基因敲低/敲除技術
為研究NLRP4E在卵母細胞中的功能，通過基因敲除技術構建NLRP4E缺失模型，并觀察肌動蛋白帽形成的變化。通過對比敲除組與正常組的差異，深入分析NLRP4E對減數分裂的影響。
3、蛋白熒光檢測
運用免疫熒光染色結合共聚焦顯微鏡觀察，來定位和檢測 NLRP4E、SRC、CDC42 以及肌動蛋白等相關蛋白在卵母細胞中的表達分布情況。
4、蛋白互作檢測
通過免疫共沉淀（Co-IP）技術分析NLRP4E與SRC、CDC42等相關蛋白的相互作用，確定它們之間可能存在的直接或間接關聯。為此，百泰派克生物科技提供了技術支持，幫助進行高效、精準的Co-IP蛋白互作分析服務，進一步推動了該研究的進展。
二、研究結果
1、NLRP4E是卵母細胞的優勢蛋白
研究團隊制備一系列單克隆抗體，并進行驗證，發現NLRP4E在卵母細胞中屬于優勢蛋白。MALDI、WB、RT-PCR結果均表明NLRP4E豐度最大，主要表達于腦、肝、睪丸和卵巢，卵巢中NLRP4E水平在產后1 ~ 21日逐漸升高（圖1 B/C/D/E/F）。NLRP4E在卵母細胞中比在GCs（顆粒細胞）中更占優勢（圖1 G/H），在卵母細胞減數分裂過程中聚集在細胞膜上（圖1 J）。
圖1. NLRP4E為卵母細胞中的優勢蛋白
2、NLRP4E敲低對影響卵母細胞減數分裂及質量的影響
該研究通過siRNA轉染進行NLRP4E敲低（KD）（圖2 A/B/C/D），并對其進行分析卵母細胞減數分裂表型。結果發現NLRP4E KD染色體更加分散，紡錘體嚴重紊亂（圖2 E/F/G/H/I/J）；Mito跟蹤染色顯示，NLRP4E KD引起線粒體聚集異常（圖2右A/B/C）， NLRP4E-KD卵母細胞內ATP濃度也顯著降低（圖2 右D），提示卵母細胞損傷嚴重；體外受精顯示NLRP4E KD顯著降低了正常受孕率（圖2右E/F）。
圖2. NLRP4E敲低使卵母細胞的減數分裂異常
3、NLRP4E敲低對肌動蛋白帽形成的影響
異常的染色體易位提示NLRP4E的功能可能與肌動蛋白帽的形成或動力學有關。結果表明，NLRP4E KD在極體擠壓過程中降低了肌動蛋白帽區Arp3的強度（圖3C和D）。
圖3. NLRP4E敲低破壞肌動蛋白帽的形成
4、NLRP4E通過S429和T430位點的磷酸化被激活
研究發現NLRP4E與NLRP4成員相比特有S429和T430（圖4 A），推測NLRP4E必須經過翻譯后修飾（例如通過磷酸化）才能遷移到肌動蛋白帽區。所以使用NLRP4E抗體進行IP，然后進行磷酸化蛋白富集。結果發現，從PND 1到PND 21，卵巢中磷酸化的NLRP4E （p-NLRP4E）水平逐漸升高（圖4 E），與總NLRP4E （t-NLRP4E）的表達模式相似；與t-NLRP4E相比，p-NLRP4E在肌動蛋白帽區強烈聚集（圖4 F），表明其在調節肌動蛋白帽形成和動力學中的作用。
為了進一步驗證S429和T430磷酸化在NLRP4E功能中的重要性，研究團隊將體外轉錄的NLRP4E- wt或S429和T430突變體mRNA注射到NLRP4E- kd卵母細胞中，并檢測其成熟率（1pb率）。結果顯示，與NLRP4E-KD卵母細胞相比，注射NLRP4E-WT mRNA顯著恢復了1pb率，而注射NLRP4E-AA mRNA進一步降低了1pb率（圖4 G/H）。因此，注射NLRP4E-WT mRNA顯著增加了帽區肌動蛋白強度，而注射NLRP4E-AA mRNA則沒有（圖4 I/J）。
圖4. NLRP4E通過S429和T430位點的磷酸化而被激活
5、免疫共沉淀方法探究p-NLRP4E如何調節肌動蛋白帽的形成
為了進一步研究p-NLRP4E如何調節肌動蛋白帽的形成，研究團隊在卵母細胞裂解液中使用NLRP4E抗體進行了IP檢測，隨后使用MALDI-TOF-MS探究了4種可能與NLRP4E相互作用的蛋白。研究發現GRIN1和GANO1與NLRP4E相互作用（圖5 B/C）， NLRP4E在細胞膜上與GNAO1共定位（圖5D），而GRIN1和GANO1敲低均顯著降低p-NLRP4E（圖5E/F/G/H）；GANO1和NLRP4E與SRC相互作用（圖5 I/J）， NLRP4E在細胞膜上與SRC共定位（圖5K），而GANO1和NLRP4E敲低都顯著降低了p-SRC（圖5L/M/N/O）；SRC與CDC42相互作用（圖5P），而NLRP4E和SRC敲低均顯著增加p-CDC42（圖5Q/R/S/T）。
圖5. GRIN1和GNAO1激活NLRP4E并調節SRC和CDC42磷酸化和肌動蛋白帽組裝
6、體外探究NLRP4E與SRC的關系
研究團隊進一步分析了NLRP4E與SRC的關系，結果發現在NLRP4E敲低的MII卵母細胞中，注射SRC- mRNA可以挽救帽的形成，這表明SRC在肌動蛋白帽的形成中與NLRP4E在功能上重疊（圖6 A/B）；發現體外純化的NLRP4E可以以劑量依賴的方式磷酸化SRC（圖6 C/D/E）。
圖6. NLRP4E直接結合并磷酸化SRC
三、研究結論
GRIN1和GNAO1磷酸化NLRP4E的Ser429和Thr430位點，然后p-NLRP4E易位并積聚在肌動蛋白帽區，通過Tyr418位點磷酸化激活SRC。p-SRC本身可以促進帽的形成，也可以下調p-CDC42的S71位點，從而促進CDC42（gtp結合形式）的活性，促進帽的形成。
圖7
研究表明，NLRP4E 在卵母細胞減數分裂過程中通過與 SRC 和 CDC42 之間的相互作用以及對它們活性的調節來實現肌動蛋白帽的形成并發揮功能。這一發現進一步完善了我們對卵母細胞減數分裂精細調控機制的認識，也為后續深入研究相關生殖疾病的發病機制（如某些因卵子質量問題導致的不孕不育）以及開發潛在的干預治療策略提供了重要的理論依據。為了深入解析NLRP4E及其調控網絡的復雜機制，精準的蛋白質組學分析不可或缺。憑借專業的技術團隊和7大質量控制檢測平臺，百泰派克生物科技致力于為研究人員提供先進的Co-IP免疫共沉淀法蛋白互作分析服務。百泰派克生物科技(BTP)采用ISO9001認證質量控制體系管理實驗室，獲國家CNAS實驗室認可，不僅能夠滿足基礎研究的高要求，還可為廣大科研工作者提供定制化的蛋白質組學相關服務。歡迎隨時與我們技術支持溝通~
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