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?目前，手術、化療和放療是治療癌癥的主要方式，因個體化的差異導致很大一部分患者不能完全治愈[1,2]。僅通過手術通常無法清除所有的癌細胞，而其他放療、化療等策略在殺死癌細胞的同時，往往會對正常組織造成嚴重的損害[3,4]。因此，開發一種既能特異性殺傷癌細胞又不會對正常細胞造成明顯損傷的策略，對癌癥治療具有重要的臨床意義。
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不可修復的DNA損傷會導致細胞死亡，癌癥的放射治療正是利用了該原理，通過電離輻射對細胞誘導不可修復的DNA損傷，不過放療造成的DNA雙鏈斷裂(DSBs)是隨機的，不具有特異性，難以避免對正常細胞的損傷[5,6]。
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隨著科學技術的不斷發展，新興的CRISPR-Cas9基因編輯技術可以實現在特定位點精準創建DSBs[7-9]。在高等真核生物中，DSBs會通過非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination, HR)修復途徑對其進行修復[10,11]。如果在抑制上述DNA修復通路的同時，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術僅對癌細胞特有的DNA進行精準切割，是否就能特異殺傷癌細胞了呢？這是海軍軍醫大學的研究者們創造性地提出的一個癌細胞特異性殺傷的構想。并且該構想被實驗證實，相關結果近期以“i-CRISPR：a personalized cancer therapy strategy through cutting cancer-specific mutations”為題，在線發表在國際權威期刊Molecular Cancer (IF=41.444) 上。海軍軍醫大學王越，楊彥勇，高福，韓超峰教授為文章的共同通訊作者，蔣俊鋒，陳媛媛和張莉為本文的并列第一作者。
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研究提出的“i-CRISPR”策略，就是根據癌細胞的DNA序列，定制且導入僅能切割癌細胞DNA的CRISPR-Cas9系統——“癌細胞CRISPR剪刀”，造成癌細胞中DNA斷裂；同時添加DNA損傷修復抑制劑(DNA damage repair inhibitor, DSBRi)，使癌細胞中斷裂的DNA無法修復，導致細胞死亡。DNA損傷修復抑制劑就是“i-CIRSPR”策略中的“i”，切割癌細胞DNA的“癌細胞CRISPR剪刀”就是“i-CIRSPR”策略中的“CRISPR”。 由于正常細胞中不含有可被“癌細胞CRISPR剪刀”切割的位點，因此其DNA不會被切割，便不會受到嚴重損傷。如此，這種“i-CRISPR”策略有望實現既能特異性殺傷癌細胞又不會對正常細胞造成明顯損傷的效果，該策略為腫瘤的精準治療提供了新的治療思路。
結果
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01“i-CRISPR”個性化癌癥治療策略的設計流程
Step 1
對患者的腫瘤樣本進行DNA測序，癌細胞與正常細胞比較篩選獨特的DNA突變位點。
Step 2
設計特異性靶向癌細胞DNA突變位點的gRNA 用于開發CRISPR-Cas9基因編輯系統。
Step 3
導入CRISPR-Cas9基因編輯系統，同時加入DSBRi于細胞中，實現對癌細胞的特異性殺傷（圖1）。
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圖1. “i-CRISPR”個性化癌癥治療策略流程圖
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02“i - CRISPR”策略通過誘導相應突變位點的DSBs殺死癌細胞
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為了驗證“i - CRISPR”策略，研究者首先通過全基因組測序分析了人肝癌細胞系HepG2的DNA序列，從1000多個潛在位點選取了8個候選靶點并設計相應的gRNA-Cas9，通過腺病毒載體導入HepG2細胞。體外實驗驗證了在CRISPR基因編輯系統導入后，HepG2細胞的編輯位點發生了DSBs事件，且DSBs標志物γH2AX表達顯著上升，然而經過相同處理的Huh7細胞（無CRISPR基因編輯靶點）有較少的DSBs事件發生。
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為了促進DSBs誘導的細胞死亡，研究人員使用靶向NHEJ（DNA-PKcs抑制劑NU7441）和HR（ATM抑制劑KU55933）修復的抑制劑[12,13]處理細胞，DSBs修復被顯著抑制，且 NU7441 + Ku55933聯合處理HepG2細胞中觀察到更多未被修復的DSBs。此外，該策略采用gRNA-Cas9慢病毒系統導入前列腺癌細胞系DU145中，在更換了DNA損傷修復的抑制劑后也同樣獲得了促進細胞凋亡的效果，且不具有耐藥性。但對正常293T細胞（無CRISPR基因編輯靶點）的活力無抑制作用。
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隨后，作者建立的類器官模型和人源腫瘤組織異種移植模型 (PDX)研究證明 “i - CRISPR”策略有效抑制腫瘤生長，小鼠體重、血生化以及血常規等數據也能夠證明該策略具有良好的生物安全性（圖2）。體內外實驗結果證明，利用CRISPR技術對突變位點特異性基因編輯并結合DNA修復抑制劑可顯著抑制腫瘤生長，該策略在腫瘤治療中具有潛在的應用價值。
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圖2. “i-CRISPR”策略特異有效殺傷癌細胞
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03“i - CRISPR”策略殺傷細胞的分子機制
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研究者利用串聯質譜對3組HepG2細胞進行定量磷酸化蛋白質組學分析來探索“i - CRISPR”策略對腫瘤細胞的殺傷機制。結果顯示，在C-Cut組和NC組之間存在少量差異磷酸化蛋白，而在C-Cut-2i組中具有獨特且差異較大的磷酸化蛋白主要位于細胞核中。GO分析結果顯示，C-Cut組中改變的DNA損傷相關磷酸化蛋白水平增加并富集在染色質組織和DNA損傷相關通路；C-Cut-2i組的差異磷酸化蛋白富集在自噬、鐵死亡、凋亡、壞死性凋亡等各種細胞死亡相關通路，尤其是自噬。因此，作者認為自噬的激活在增加C-CUT-2i組細胞死亡的分子機制中發揮了關鍵作用。
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通過全基因組甲基化測序(WGBS)結果證明gRNA-Cas9和DSBRis策略并沒有明顯改變細胞系中DNA甲基化相關的表觀遺傳調控。但相較于對照細胞卻存在一些差異甲基化區域(DMRs)，且DMRs定位基因富集在細胞死亡、程序性細胞死亡和染色體組織以及凋亡通路中。
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癌癥治療面臨的另一個難題是不斷突變的癌細胞的進化。研究者對DU145的三個單克隆株A6（培養約60代）、B12和B13（培養約80代）分別進行全基因組測序，發現單克隆株在進化過程中產生新的突變，呈現異質性。但僅有少部分是其特有的(A6: 17.11%;B12: 32.10%;B13: 38.72%)，大多數原始突變得以保留。此外，本研究的DU145數據與公開的DU145突變數據進行對比也證明超過一半的原始突變仍然保留（圖3）。
圖3. “i-CRISPR”策略殺傷細胞的分子機制
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結論
研究表明：“i - CRISPR”策略可以實現對癌細胞的特異性殺傷，而對正常細胞不造成明顯損傷，并且，該策略在解決當前癌癥治療所面臨的癌癥進化問題上也有很大的優勢。隨著測序和克隆進化分析等生物信息學技術的發展，將從患者身上識別出所有癌細胞普遍存在的原始突變基因，解決癌癥異質性帶來的問題。通過CRISPR基因編輯系統結合DNA損傷修復抑制劑誘導腫瘤細胞特異性DSBs，加速細胞死亡，可作為腫瘤精準治療的一種新策略，為個體化腫瘤治療提供新思路。
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