腸道上皮行使多種功能，對維持腸道穩態至關重要。健康結腸和結腸癌中均存在維持在干細胞樣的上皮細胞亞群，其機制卻不盡相同。結腸上皮細胞狀態受包括內源性癌基因突變和外源性基質信號在內的多種因素調控。不過，內源性和外源性信號如何共同調節、決定細胞命運仍不清楚。因此，倫敦大學學院（University College London）癌癥研究所的Christopher Tape團隊利用質譜流式等技術對結腸干細胞極化進行了全面研究，其成果于2023年12月在線發表于《Cell》。
類器官（organoid）因其3D結構、可體外培養、基因編輯和高通量篩選等優點，自面世以來已成為重要的臨床前模型。為闡明常見的癌基因突變和間質細胞如何影響結腸上皮細胞分化，團隊先使用單細胞測序技術分析了不同基因型（野生型(WT)、shApc(A)、shApc;KrasG12D/+(AK)、shApc;KrasG12D/+; Trp53R172H/− (AKP)）的類器官單獨培養或與結腸成纖維細胞和巨噬細胞共同培養時的表型。分析發現，成纖維細胞可將野生型類器官誘導成重生型干細胞（revCSC），而A、AK和AKP突變則使上皮細胞逐漸分化成過度增殖態（proCSC），且AK和AKP上皮細胞無法被成纖維細胞誘導成revCSC。這說明成纖維細胞和癌基因能將上皮細胞向不同的去分化狀態極化。
為了突破單細胞測序的通量限制并對進行功能分析，團隊使用質譜流式技術進一步研究上皮細胞極化。研究者使用金屬同位素對類器官進行了原位Barcode標記后，對不同的類器官培養進行混樣和抗體染色。實驗用到包括抗體和Barcode等在內的共53個通道，分析了390個不同類器官培養的約六百萬單細胞。質譜流式不僅印證了上述單細胞測序結果，更對培養基中每個配體（WNT3A、EGF、Noggin和R-Spondin-1 (WENR)）的作用進行了分析，表明KrasG12D突變重塑了上皮細胞對經典β-catenin信號的響應。這些結果進一步說明了APC缺失和KRAS突變占有主導地位，讓上皮細胞陷入proCSC狀態而不受胞外信號調控。
圖1.（A）質譜流式研究基因型、配體和共培養條件的實驗設計；（B）基因型、（C）微環境、（D）配體和（E）細胞類型標志物對類器官的影響
研究者接下來繼續研究上皮細胞如何受WENR配體調節，發現結腸上皮細胞的分化狀態受配體和癌基因突變的競爭影響而在一個多變量的連續譜上變化。并且，revCSC和proCSC可由特征性磷酸化信號表征。團隊使用質譜流式更加深入地研究了使用其他基質配體對不同基因型類器官處理后上皮細胞分化、細胞狀態和翻譯后修飾信號，表明了WNT3A和TGF-β1可促進WT和A上皮細胞向revCSC轉變，而ERBB通路則將上皮細胞推向proCSC方向。與先前結果類似的是，AK和AKP上皮細胞與基質間的交流減弱，從而對外界信號刺激無響應。
圖2.（A）類器官表型受基因型和WENR配體調控；（B）revCSC、穩態和proCSC標志物
圖3. 基質配體對不同基因型上皮細胞的影響
研究團隊繼續建立了一個以基因突變、控制干細胞極化的配體和不同胞內信號通路抑制劑為變量的實驗，從多個方向分析細胞內源性和外源性信號如何競爭以決定干細胞極化方向。團隊建立了相對干性（RS）打分以評估各因素對極化的影響，該打分可有效反映proCSC和revCSC的極化狀態。AK上皮細胞擁有高RS打分，而使用TGF-β1或PI3Ki處理AK類器官可有效降低該打分，TGF-β1和PI3Ki同時處理甚至可將上皮細胞逆轉為revCSC主導的狀態。這說明結腸癌細胞亦可向revCSC極化，但需要高TGF-β1和低PI3K信號?？傮w而言，YAP是revCSC的核心調控者，而PI3K和MAPK則對維持proCSC狀態至關重要。
圖4.（A）質譜流式研究內源、外源信號影響的實驗設計；（B）基因型、（C）配體、（D）抑制劑和（E）細胞類型標志物對類器官的影響；（F）RS打分展示基因型、配體和細胞狀態對極化的影響
質譜流式作為一項備受青睞的高通量單細胞技術，具有多通道、背景低、易兼容胞內染色等特點，可在單個細胞層面分析超過五十種標志物。倫敦大學學院的研究團隊此次充分利用質譜流式的技術優勢，使用原位Barcoding技術對類器官進行標記，從而達成對類器官的高通量單細胞分析；在此基礎上實現了上皮細胞分化狀態、細胞周期和信號通路的同時表征，繪制了結腸干細胞極化的連續性表型圖譜，闡明了內源性和外源性信號對其表型的影響。該工作為使用質譜流式進行類器官研究確立了一個極好的范例，展示了質譜流式在利用類器官進行涉及多變量的復雜機制研究中的強大能力。
參考文獻：
Qin et al., An oncogenic phenoscape of colonic stem cell polarization, Cell (2023), https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.11.004
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